ថ្នាំសម្លាប់សត្វល្អិតដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់ក្នុងការដោះស្រាយកង្វះខាតស្បៀងអាហារទូទាំងពិភពលោក និងប្រយុទ្ធប្រឆាំងនឹងជំងឺដែលឆ្លងតាមរយៈវ៉ិចទ័រ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ បញ្ហាកាន់តែខ្លាំងឡើងនៃភាពធន់នឹងថ្នាំសម្លាប់សត្វល្អិតទាមទារឱ្យមានការរកឃើញសមាសធាតុថ្មីៗដែលកំណត់គោលដៅគោលដៅដែលមិនបានប្រើប្រាស់គ្រប់គ្រាន់។ បណ្តាញសក្តានុពលអ្នកទទួលបណ្ដោះអាសន្នរបស់សត្វល្អិត (TRPV) — Nanzhong (Nan) និងអសកម្ម (Iav) — អាចបង្កើតបណ្តាញមិនដូចគ្នា (Nan-Iav) និងធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្មទៅកាន់សរីរាង្គមេកានិចដែលសម្របសម្រួល geotropism ការស្តាប់ និងការយល់ឃើញផ្ទាល់ខ្លួននៅក្នុងសត្វល្អិត។ ថ្នាំសម្លាប់សត្វល្អិតមួយចំនួន ដូចជា aphidopyrrolidone (AP) កំណត់គោលដៅ Nan-Iav តាមរយៈយន្តការដែលមិនស្គាល់។ AP មានប្រសិទ្ធភាពប្រឆាំងនឹងសត្វល្អិតដែលជញ្ជក់ទម្លុះ (hemipterans) ដែលការពារការស៊ីចំណីដោយរំខានដល់មុខងាររបស់ខ្សែស្រឡាយ។ AP អាចភ្ជាប់តែជាមួយ Nan ប៉ុន្តែមានតែ Nan-Iav ប៉ុណ្ណោះដែលអាចធ្វើអន្តរកម្មជាមួយសារធាតុ agonist រួមទាំង nicotinamide ខាងក្នុង (NAM) ដោយហេតុនេះបង្ហាញសកម្មភាពបណ្តាញ។ ទោះបីជាសក្តានុពលរបស់ Nan-Iav ជាគោលដៅថ្នាំសម្លាប់សត្វល្អិតក៏ដោយ ក៏មានការដឹងតិចតួចអំពីការផ្គុំបណ្តាញរបស់វា កន្លែងភ្ជាប់បទប្បញ្ញត្តិ និងបទប្បញ្ញត្តិដែលពឹងផ្អែកលើ Ca2+ ដែលរារាំងការអភិវឌ្ឍថ្នាំសម្លាប់សត្វល្អិតបន្ថែមទៀត។ នៅក្នុងការសិក្សានេះ មីក្រូទស្សន៍អេឡិចត្រុងត្រជាក់ត្រូវបានប្រើដើម្បីកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធ Nan-Iav នៅក្នុងសត្វល្អិត Hemiptera ក្នុងស្ថានភាពគ្មានកាល់ម៉ូឌូលីន-លីហ្គែន ក៏ដូចជាជាមួយ AP និង NAM នៅព្រំដែននៃដែនស៊ីតូប្លាស្មិកម្តងទៀតរបស់អាន់គីរីន (ARD)។ គួរឱ្យភ្ញាក់ផ្អើល យើងបានរកឃើញថា ប្រូតេអ៊ីន Nan ខ្លួនវាអាចបង្កើតជា pentamer ដែលត្រូវបានធ្វើឱ្យមានស្ថេរភាពដោយអន្តរកម្ម ARD ដែលសម្របសម្រួលដោយ AP។ ការសិក្សានេះបង្ហាញពីអន្តរកម្មម៉ូលេគុលរវាងថ្នាំសម្លាប់សត្វល្អិត និងសារធាតុ agonist និង Nan-Iav ដោយបញ្ជាក់ពីសារៈសំខាន់នៃ ARD នៅក្នុងមុខងារឆានែល និងការផ្គុំ និងស្វែងយល់ពីយន្តការនៃបទប្បញ្ញត្តិ Ca2+។
ប្រឆាំងនឹងផ្ទៃខាងក្រោយនៃការប្រែប្រួលអាកាសធាតុពិភពលោកកាន់តែធ្ងន់ធ្ងរឡើងៗ សន្តិសុខស្បៀងអាហារពិភពលោកកាន់តែយ៉ាប់យ៉ឺន គឺជាបញ្ហាប្រឈមចម្បងមួយនៃសតវត្សរ៍ទី ២១ ដែលមានផលវិបាកជាបន្តបន្ទាប់សម្រាប់សង្គម។១,២របាយការណ៍ស្ថានភាពសន្តិសុខស្បៀង និងអាហារូបត្ថម្ភនៅលើពិភពលោកឆ្នាំ ២០២៣ (SOFI) របស់អង្គការសុខភាពពិភពលោកប៉ាន់ប្រមាណថា មនុស្សប្រមាណ ២,៣៣ ពាន់លាននាក់នៅទូទាំងពិភពលោកកំពុងរងទុក្ខដោយសារអសន្តិសុខស្បៀងកម្រិតមធ្យមទៅធ្ងន់ធ្ងរ ដែលជាបញ្ហាយូរអង្វែងមួយ។៣,៤ជាអកុសល ទិន្នផលដំណាំប្រមាណ 20% ទៅ 30% ឬច្រើនជាងនេះ ត្រូវបានបាត់បង់ជារៀងរាល់ឆ្នាំដោយសារសត្វល្អិត និងភ្នាក់ងារបង្កជំងឺ ហើយការឡើងកំដៅផែនដីត្រូវបានគេរំពឹងថានឹងធ្វើឱ្យកាន់តែធ្ងន់ធ្ងរឡើងនូវភាពធន់នឹងសត្វល្អិត និងភាពងាយរងគ្រោះរបស់ដំណាំ។៤,៥,៦,៧,៨ការអភិវឌ្ឍថ្នាំសម្លាប់សត្វល្អិតមានសារៈសំខាន់មិនត្រឹមតែដើម្បីការពារដំណាំពីសត្វល្អិត និងកាត់បន្ថយការរីករាលដាលនៃភ្នាក់ងារបង្កជំងឺដែលឆ្លងតាមវ៉ិចទ័រប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែថែមទាំងប្រយុទ្ធប្រឆាំងនឹងជំងឺដែលឆ្លងតាមវ៉ិចទ័ររបស់មនុស្សដូចជាជំងឺគ្រុនឈាម ជំងឺគ្រុនចាញ់ និងជំងឺ Chagas ដែលកាន់តែធន់នឹងថ្នាំសម្លាប់សត្វល្អិត។៥,៩,១០,១១
ក្នុងចំណោមគោលដៅសំខាន់ៗនៃថ្នាំសម្លាប់សត្វល្អិតដែលមានជាតិពុលដល់សរសៃប្រសាទ ឆានែល TRPV heterotetrameric Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) តំណាងឱ្យថ្នាក់នៃគោលដៅថ្នាំសម្លាប់សត្វល្អិតដែលត្រូវបានរកឃើញតែក្នុងទសវត្សរ៍ចុងក្រោយនេះប៉ុណ្ណោះ រួមទាំងថ្នាំសម្លាប់សត្វល្អិតដែលមានលក់នៅលើទីផ្សារដូចជា imidacloprid និង pyraclostrobin។១២, ១៣, ១៤ថ្នាំសម្លាប់សត្វល្អិតពាក់កណ្តាលសំយោគ aphidopyrrolifen (AP) គឺជាផលិតផលដែលទើបត្រូវបានអភិវឌ្ឍ និងធ្វើពាណិជ្ជកម្មថ្មីៗនេះ ដែលសមាសធាតុសំខាន់របស់វាគឺថ្នាំសម្លាប់សត្វល្អិតសកម្ម Inscalis® ដែលភ្ជាប់ AP នៅកម្រិតសកម្មភាព subnanomolar។15ថ្នាំ AP បង្ហាញជាតិពុលស្រួចស្រាវទាបចំពោះសត្វល្អិតលំអង សត្វល្អិតមានប្រយោជន៍ និងសារពាង្គកាយមិនមែនគោលដៅផ្សេងទៀត ហើយនៅពេលប្រើប្រាស់តាមការណែនាំនៅលើស្លាក វាអាចកាត់បន្ថយសម្ពាធធន់នឹងថ្នាំសម្លាប់សត្វល្អិតដទៃទៀត។១៦, ១៧, ១៨Nan និង Iav ត្រូវបានចែកចាយយ៉ាងទូលំទូលាយនៅទូទាំងប្រភេទសត្វល្អិត ត្រូវបានបញ្ចេញរួមគ្នាតែនៅក្នុងណឺរ៉ូនទទួលសរសៃនៃអង់តែន និងអវយវៈ ហើយមានសារៈសំខាន់សម្រាប់ការស្តាប់ ការយល់ឃើញទំនាញផែនដី និងការយល់ឃើញពីសមត្ថភាព។១៣, ១៦, ១៩, ២០, ២១, ២២AP, imidacloprid និង pyraclostrobin ជំរុញស្មុគស្មាញ Nan-Iav តាមរយៈយន្តការពិសេសមួយ ដែលនៅទីបំផុតរារាំងការបញ្ជូនសញ្ញា proprioceptive។១៣, ១៦, ២៣ចំពោះសត្វល្អិតដែលជញ្ជក់ទម្លុះ (សត្វ hemipterans) ដូចជាសត្វកណ្ដៀរ និងសត្វរុយស ការបាត់បង់សមត្ថភាពដឹងខ្លួន ធ្វើឱ្យចុះខ្សោយសមត្ថភាពស៊ីចំណីរបស់ពួកវា ដែលនៅទីបំផុតនាំឱ្យស្លាប់។១៣,២៤គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ AP បង្ហាញពីទំនាក់ទំនងខ្ពស់ចំពោះស្មុគស្មាញ Nan-Iav និងទំនាក់ទំនងទាបចំពោះ Nan តែមួយមុខ។ ការភ្ជាប់ AP ទៅនឹង Nan-Iav បង្កឱ្យមានចរន្តអគ្គិសនី ប៉ុន្តែការភ្ជាប់ទៅ Nan តែមួយមុខមិនជំរុញសកម្មភាពឆានែលទេ។ Iav ខ្លួនវាមិនភ្ជាប់ទៅនឹង AP ទាល់តែសោះ។16នេះបង្ហាញថា Nan និង Iav អាចភ្ជាប់គ្នាដើម្បីបង្កើតជាស្មុគស្មាញឆានែល Nan-Iav ផ្សេងៗគ្នា (ឧទាហរណ៍ ជាមួយនឹងសមាមាត្រស្តូគីយ៉ូម៉ែត្រិចខុសៗគ្នា ឬការរៀបចំផ្សេងៗគ្នាក្នុងសមាមាត្រស្តូគីយ៉ូម៉ែត្រិចដូចគ្នា) ឬថា AP អាចភ្ជាប់ទៅកន្លែងច្រើន។ លើសពីនេះ សារធាតុ nicotinamide ធម្មជាតិ (NAM) ភ្ជាប់ទៅនឹង Drosophila Nan-Iav ជាមួយនឹងភាពស្និទ្ធស្នាលមីក្រូម៉ូឡា ដែលបង្ហាញប្រសិទ្ធភាពស្រដៀងគ្នាទៅនឹងសត្វល្អិត (AP) នៅក្នុងវីត្រូ។១៦,២៥និងរារាំងការបន្តពូជ និងការស៊ីចំណីរបស់សត្វកណ្តៀរ ដែលនៅទីបំផុតនាំឱ្យពួកវាងាប់២៥,២៦ទិន្នន័យទាំងនេះលើកឡើងនូវសំណួរជាច្រើន។ ឧទាហរណ៍ វានៅតែមិនច្បាស់លាស់ថាតើ heterodimer Nan-Iav ត្រូវបានបង្កើតឡើងយ៉ាងដូចម្តេច ដែលកន្លែងភ្ជាប់ណាដែលត្រូវបានប្រើដើម្បីកែប្រែម៉ូលេគុលតូចៗ និងរបៀបដែលម៉ូលេគុលតូចៗទាំងនេះគ្រប់គ្រងមុខងារឆានែលដោយការទប់ស្កាត់ proprioception។ លើសពីនេះ ហេតុផលដែល Nan ខ្លួនវាអសកម្ម និងមានទំនាក់ទំនងទាបចំពោះ AP ខណៈពេលដែល heterodimer Nan-Iav សកម្ម និងភ្ជាប់ AP ជាមួយនឹងទំនាក់ទំនងខ្ពស់ជាង នៅតែមិនច្បាស់លាស់។ ជាចុងក្រោយ មានព័ត៌មានតិចតួចណាស់អំពីបទប្បញ្ញត្តិដែលពឹងផ្អែកលើ Ca2+ នៃមុខងារ Nan-Iav និងរបៀបដែលវាត្រូវបានរួមបញ្ចូលទៅក្នុងដំណើរការសញ្ញាណឺរ៉ូន។១៣,២១
នៅក្នុងការសិក្សានេះ ដោយរួមបញ្ចូលគ្នានូវមីក្រូទស្សន៍អេឡិចត្រុងគ្រីយ៉ូ អេឡិចត្រូសរីរវិទ្យា និងបច្ចេកទេសចងភ្ជាប់វិទ្យុសកម្ម យើងបានបញ្ជាក់ពីការផ្គុំ Nan-Iav និងយន្តការនៃការភ្ជាប់របស់វាទៅនឹងសារធាតុកំណត់ម៉ូលេគុលតូចៗ។ លើសពីនេះ យើងបានរកឃើញកាល់ម៉ូឌូលីន (CaM) ដែលភ្ជាប់ជាប់លាប់ទៅនឹង Iav និង AP-stabilized Nan pentamers។ លទ្ធផលទាំងនេះផ្តល់នូវការយល់ដឹងសំខាន់ៗអំពីការគ្រប់គ្រងអ៊ីយ៉ុងកាល់ស្យូមនៅក្នុងបណ្តាញ ការផ្គុំបណ្តាញ និងកត្តាដែលកំណត់ទំនាក់ទំនងចងភ្ជាប់សារធាតុកំណត់។ អ្វីដែលសំខាន់ជាងនេះទៅទៀត យើងបានបញ្ជាក់ថា ARD ដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់នៅក្នុងដំណើរការទាំងនេះ។ ការសិក្សារបស់យើងអំពីបណ្តាញសត្វល្អិតពេញលេញដែលភ្ជាប់ទៅនឹងថ្នាំសម្លាប់សត្វល្អិតកសិកម្មពាក់ព័ន្ធ។២៧, ២៨, ២៩បើកឱកាសសម្រាប់ការអភិវឌ្ឍឧស្សាហកម្មថ្នាំសម្លាប់សត្វល្អិត ដោយធ្វើអោយប្រសើរឡើងនូវប្រសិទ្ធភាព និងភាពជាក់លាក់នៃថ្នាំសម្លាប់សត្វល្អិត និងអាចឱ្យអនុវត្តសមាសធាតុដែលកំណត់គោលដៅ TRPV ទៅលើប្រភេទសត្វដទៃទៀត ដើម្បីដោះស្រាយសន្តិសុខស្បៀងអាហារសកល និងការរីករាលដាលនៃជំងឺដែលឆ្លងតាមវ៉ិចទ័រ។
យើងក៏បានរកឃើញផងដែរថា Nan-Iav ត្រូវបានគ្រប់គ្រងដោយ Ca2+ ហើយយន្តការនៃបទប្បញ្ញត្តិត្រូវបានសម្របសម្រួលដោយ CaM ដែលចងភ្ជាប់ជាលំដាប់។ អ្វីដែលសំខាន់នោះ បទប្បញ្ញត្តិដែលពឹងផ្អែកលើ Ca2+ នៃ Nav ដោយ CaM គឺខុសគ្នាយ៉ាងខ្លាំងពីយន្តការនៃបទប្បញ្ញត្តិនៃបណ្តាញអ៊ីយ៉ុងផ្សេងទៀត (ឧទាហរណ៍ បណ្តាញ Na+ ដែលមានវ៉ុលកំណត់ និងបណ្តាញ TRPV5/6)។៥២, ៥៣, ៥៤, ៥៥, ៥៦, ៥៧នៅក្នុងឆានែល Nav1.2 ដែន C-terminal នៃ CaM ភ្ជាប់ជារាងវង់ជាមួយដែន C-terminal (CTD) ហើយ Ca2+ បង្កឱ្យមានការភ្ជាប់ដែន N-terminal របស់វាទៅនឹងផ្នែកឌីស្តាល់នៃ CTD។56នៅក្នុងឆានែល TRPV5/6 ដែន C-terminal នៃ CaM ភ្ជាប់ទៅនឹង CTH ហើយ Ca2+ បង្កឱ្យមានការពង្រីកឡើងលើនៃដែន N-terminal របស់វាចូលទៅក្នុងរន្ធញើស ដោយហេតុនេះរារាំងភាពជ្រាបចូលនៃកាតូន។៥៣,៥៤យើងស្នើគំរូសម្រាប់មុខងារដែលគ្រប់គ្រងដោយ Ca2+ នៃ Nan-Iav-CaM (រូបភាពទី 4h)។ នៅក្នុងគំរូនេះ ដែន N-terminal នៃ CaM ភ្ជាប់ជាប់លាប់ទៅនឹងដែន C-terminal (CTH) នៃ Iav។ នៅក្នុងស្ថានភាពសម្រាក (កំហាប់ [Ca2+] ទាប) ដែន C-terminal នៃ CaM មានអន្តរកម្មជាមួយ Nan ដែលធ្វើឱ្យរចនាសម្ព័ន្ធ ARD មានស្ថេរភាព និងដោយហេតុនេះជំរុញការបើកឆានែល។ ការភ្ជាប់នៃសារធាតុ agonist/ថ្នាំសម្លាប់សត្វល្អិតទៅនឹងឆានែលបង្កឱ្យមានការបើករន្ធញើស ដែលនាំឱ្យមានការហូរចូល Ca2+។ បន្ទាប់មក Ca2+ ភ្ជាប់ទៅនឹង CaM បណ្តាលឱ្យមានការបំបែកដែន C-terminal ពី ARD នៃ Nan។ ដោយសារតែការរារាំងការភ្ជាប់ CaM លុបបំបាត់ឥទ្ធិពលរារាំងរបស់ Ca2+ ការបំបែកនេះធ្វើឱ្យការចល័ត ARD មានលក្ខណៈប្រែប្រួល ដោយហេតុនេះបណ្តាលឱ្យមានការរារាំង ឬការថយចុះភាពរសើបដែលពឹងផ្អែកលើ Ca2+។ ការងើបឡើងវិញយ៉ាងឆាប់រហ័សនៃចរន្តឆានែលបន្ទាប់ពីការរំលាយអ៊ីយ៉ុងកាល់ស្យូម (រូបភាពទី 4g) បង្ហាញថាយន្តការនេះជួយសម្រួលដល់ការឆ្លើយតបយ៉ាងឆាប់រហ័សចំពោះសញ្ញាណឺរ៉ូនដែលសម្របសម្រួលដោយ Ca2+។ លើសពីនេះ តំបន់ C-terminal នៃ Iav ដែលនៅតែមិនទាន់យល់ច្បាស់នៅឡើយ ត្រូវបានគេរាយការណ៍ថាដើរតួនាទីផ្សេងទៀតក្នុងការកំណត់គោលដៅឆានែល និងបទប្បញ្ញត្តិបច្ចុប្បន្ន។
ជាចុងក្រោយ ការសិក្សារបស់យើងបង្ហាញពីរចនាសម្ព័ន្ធដែលមានគុណភាពបង្ហាញខ្ពស់នៃស្មុគស្មាញឆានែល TRP ថ្នាំសម្លាប់សត្វល្អិតដែលមានសារៈសំខាន់ខាងកសិកម្ម - ការរកឃើញដែលយើងមិនធ្លាប់ស្គាល់ពីមុនមក។ ជាពិសេស យើងបានកំណត់លក្ខណៈរចនាសម្ព័ន្ធ និងមុខងារនៃឆានែលសត្វល្អិតនៅក្នុងកោសិកាមនុស្ស (HEK293S GnTi–) ជាជាងនៅក្នុងកោសិកាសត្វល្អិត។ នៅចំពោះមុខភាពធន់នឹងថ្នាំសម្លាប់សត្វល្អិតកាន់តែកើនឡើង និងសម្ពាធជាបន្តបន្ទាប់លើសន្តិសុខស្បៀង និងភ្នាក់ងារបង្ករោគ ការងាររបស់យើងផ្តល់នូវព័ត៌មានសំខាន់ៗដែលនឹងជួយសម្រួលដល់ការអភិវឌ្ឍថ្នាំសម្លាប់សត្វល្អិតថ្មីសម្រាប់ផលប្រយោជន៍សុខភាពមនុស្ស និងសន្តិសុខស្បៀងសកល។ ការសិក្សាបានបង្ហាញថា ថ្នាំសម្លាប់សត្វល្អិតដូចជា AP មានប្រសិទ្ធភាពប្រឆាំងនឹងសត្វល្អិតមួយចំនួននៅពេលប្រើតាមការណែនាំនៅលើស្លាក និងមានជាតិពុលស្រួចស្រាវទាបចំពោះសត្វល្អិតលំអងដែលមានប្រយោជន៍ ដែលបង្ហាញពីសុវត្ថិភាពបរិស្ថានរបស់វា។១៣,១៦លើសពីនេះ ការធ្វើតេស្តលើសារធាតុ AP មួយចំនួនលើមូសបានបង្ហាញថា នៅទីបំផុតពួកវាបាត់បង់សមត្ថភាពក្នុងការហើរ។ ការយល់ដឹងពីរបៀបដែលសមាសធាតុកែប្រែទាំងនេះភ្ជាប់ទៅនឹង Nan-Iav នឹងជួយសម្រួលដល់ការកែប្រែសមាសធាតុដែលមានស្រាប់ ឬការអភិវឌ្ឍសមាសធាតុថ្មីសម្រាប់ប្រសិទ្ធភាព និង...ច្បាស់លាស់ការគ្រប់គ្រងសត្វល្អិត។ ការសិក្សារបស់យើងបង្ហាញថា ចំណុចប្រទាក់ Nan-Iav ARD គឺមានសារៈសំខាន់មិនត្រឹមតែសម្រាប់ការគ្រប់គ្រងសកម្មភាពរបស់សមាសធាតុ endogenous ថ្នាំសម្លាប់សត្វល្អិត និង Ca2+-CaM ប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែថែមទាំងសម្រាប់ការផ្គុំឆានែលផងដែរ។ យើងស្នើថា ការរំខានដល់ការផ្គុំ heterodimer ជាមួយម៉ូលេគុលតូចៗអាចជាវិធីសាស្រ្តពិសេស និងមានជោគជ័យសម្រាប់ការអភិវឌ្ឍសារធាតុទប់ស្កាត់ឆានែលអ៊ីយ៉ុង។
ក្នុងចំណោមហ្សែនអ័រថូឡូកទាំងប្រាំបី ហ្សែនប្រវែងពេញរបស់សត្វកណ្ដៀរពណ៌ត្នោត (Halyomorpha halys) Nanchung និង Inactive ត្រូវបានជ្រើសរើស ដោយបង្ហាញពីស្ថេរភាពដ៏ល្អឥតខ្ចោះនៅក្នុងសាប៊ូបោកខោអាវ។ ហ្សែនសំយោគត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរសម្រាប់ការបញ្ចេញមតិរបស់មនុស្ស ហើយត្រូវបានក្លូនចូលទៅក្នុងវ៉ិចទ័រ pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) ដោយប្រើកន្លែងរឹតបន្តឹង XhoI និង EcoRI។ នេះធានាថាក្លូនស្ថិតនៅក្នុងស៊ុមជាមួយស្លាក C-terminal GFP-FLAG-10xHis និង mCherry-FLAG-10xHis ដែលត្រូវបានកាត់ដោយប្រូតេអាស HRC-3C (PPX) ដែលអនុញ្ញាតឱ្យមានភាពឯករាជ្យ។ការបញ្ចេញមតិប្រាយមឺរដែលប្រើដើម្បីក្លូន Nanchung និង Inactive ទៅក្នុងវ៉ិចទ័រ pBacMam មានដូចខាងក្រោម៖
រូបភាពមីក្រូទស្សន៍នៃភាគល្អិតនីមួយៗត្រូវបានទទួលនៅលើមីក្រូទស្សន៍អេឡិចត្រុងបញ្ជូន Titan Krios G2 (FEI) ដែលបំពាក់ដោយកាមេរ៉ា K3 និងតម្រងថាមពល Gatan BioQuantum។ មីក្រូទស្សន៍នេះត្រូវបានដំណើរការនៅ 300 keV ជាមួយនឹងការកំណត់ថាមពល 20 eV ទំហំភីកសែលគំរូ 1.08 Å/ភីកសែល (ការពង្រីកនាម 81,000x) និងជម្រាលការផ្ដោតចាប់ពី -0.8 ដល់ -2.2 μm។ ការថតវីដេអូត្រូវបានអនុវត្តក្នុងល្បឿន 40 ហ្វ្រេមក្នុងមួយវិនាទីដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍ Latitude S (Gatan) ជាមួយនឹងអត្រាកម្រិតថ្នាំនាម 25 e–px−1 s−1 ពេលវេលាប៉ះពាល់ 2.4 s និងកម្រិតថ្នាំសរុបប្រហែល 60 e–Å−2។
ការកែតម្រូវចលនាដែលបង្កឡើងដោយធ្នឹម និងការកំណត់ទម្ងន់កម្រិតថ្នាំត្រូវបានអនុវត្តលើខ្សែភាពយន្តដោយប្រើ MotionCor2 នៅក្នុង RELION 4.061។ ការប៉ាន់ស្មានប៉ារ៉ាម៉ែត្រមុខងារផ្ទេរកម្រិតពណ៌ (CTF) ត្រូវបានអនុវត្តនៅក្នុង cryoSPARC ដោយប្រើវិធីសាស្ត្រប៉ាន់ស្មាន CTF ដែលមានមូលដ្ឋានលើបំណះ62។ រូបថតមីក្រូក្រាហ្វដែលមានគុណភាពបង្ហាញសម CTF ≥4 Å ត្រូវបានដកចេញពីការវិភាគជាបន្តបន្ទាប់។ ជាធម្មតា សំណុំរងនៃរូបថតមីក្រូក្រាហ្វចំនួន 500–1000 ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការជ្រើសរើសចំណុចនៅក្នុង cryoSPARC បន្ទាប់មកដោយការចាត់ថ្នាក់ 2D ជាច្រើនជុំបន្ទាប់ពីការត្រងដើម្បីទទួលបានរូបភាពយោងច្បាស់លាស់សម្រាប់ការជ្រើសរើសភាគល្អិតដែលមានមូលដ្ឋានលើគំរូ។ បន្ទាប់មកភាគល្អិតត្រូវបានស្រង់ចេញដោយប្រើប្រអប់ព្រំដែន 64 ភីកសែល និងការដាក់ធុងសំរាម 4 ដង។ ការចាត់ថ្នាក់ 2D ជាច្រើនជុំត្រូវបានអនុវត្តដើម្បីលុបប្រភេទភាគល្អិតដែលមិនចង់បាន។ គំរូ 3D ដំបូងត្រូវបានកសាងឡើងវិញដោយប្រើការកសាងឡើងវិញ ab initio និងចម្រាញ់ដោយប្រើការចម្រាញ់មិនស្មើគ្នានៅក្នុង cryoSPARC។ ការចាត់ថ្នាក់ 3D ត្រូវបានអនុវត្តនៅក្នុង cryoSPARC ឬ RELION ដោយផ្អែកលើភាពខុសគ្នានៃ ARD។ មិនមានភាពខុសគ្នាសំខាន់នៃដែនភ្នាសត្រូវបានគេសង្កេតឃើញទេ។ ភាគល្អិតត្រូវបានចម្រាញ់ដោយប្រើវិធីសាស្ត្រ C1 និង C2; ភាគល្អិតដែលមានគុណភាពបង្ហាញ C2 ខ្ពស់ជាងត្រូវបានចាត់ទុកថាស៊ីមេទ្រីទាក់ទងទៅនឹង C2 ហើយនាំចូលទៅក្នុង RELION សម្រាប់ការចម្រាញ់បែប Bayesian។ បន្ទាប់មកភាគល្អិតត្រូវបានផ្ទេរត្រឡប់ទៅ cryoSPARC វិញសម្រាប់ការចម្រាញ់ចុងក្រោយដែលមិនស្មើគ្នា និងក្នុងមូលដ្ឋាន។ គុណភាពបង្ហាញចុងក្រោយ និងចំនួនភាគល្អិតត្រូវបានបង្ហាញក្នុងតារាងទី 1។
នៅពេលដំណើរការ Nan+AP pentamers យើងបានស្វែងយល់ពីវិធីសាស្រ្តផ្សេងៗសម្រាប់កែលម្អគុណភាពបង្ហាញនៃដែនភ្នាស (ជាពិសេសតំបន់រន្ធញើស) ដូចជាការដកសញ្ញា និងការបិទបាំង TMD។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការប៉ុនប៉ងទាំងនេះមិនបានជោគជ័យទេ ដោយសារតែភាពមិនប្រក្រតីដែលអាចកើតមានខ្លាំងនៅក្នុងតំបន់រន្ធញើស និងភាពមិនដូចគ្នាទាំងមូលនៃ TMD។ គុណភាពបង្ហាញចុងក្រោយត្រូវបានគណនាដោយប្រើរបាំងដែលបង្កើតដោយស្វ័យប្រវត្តិដោយវិធីសាស្ត្រដំណើរការមិនស្មើគ្នានៅក្នុង cryoSPARC ដែលផ្តោតជាចម្បងលើតំបន់ ARD។ នេះសម្រេចបានគុណភាពបង្ហាញខ្ពស់ជាងដែនភ្នាស (ជាពិសេសតំបន់ VSLD)។
គំរូ de novo ដំបូងនៃទម្រង់ apo នៃកំហុស Nanchung និងអសកម្មត្រូវបានបង្កើតដំបូងដោយប្រើ Coot63 ហើយគំរូនៃកំហុស Nan និង Iav ត្រូវបានបង្កើតដោយប្រើ AlphaFold264 ដើម្បីកំណត់តំបន់ដែលមានទំនុកចិត្តទាប។ គំរូ Calmodulin គឺផ្អែកលើការសមរាងកាយរឹងនៃគំរូភ្ជាប់ Ca2+ និងគំរូគ្មាន Ca2+ នៅក្នុង PDB accessions 4JPZ56 និង 1CFD65 រៀងៗខ្លួន។ គំរូត្រូវបានកែលម្អដោយប្រើការកែលម្អស្វ៊ែរដើម្បីធានាបាននូវស្តេរ៉េអូគីមីត្រឹមត្រូវ និងធរណីមាត្រល្អ។ បន្ទាប់មក Phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine និង phosphatidylserine ត្រូវបានធ្វើគំរូជាដង់ស៊ីតេ lipid ដែលបានកំណត់យ៉ាងល្អ ហើយសារធាតុភ្ជាប់ NAM និង AP ត្រូវបានដាក់ក្នុងដង់ស៊ីតេដែលត្រូវគ្នានៅក្នុងចំណុចប្រសព្វតឹង។ ឯកសាររឹតបន្តឹងត្រូវបានបង្កើតចេញពីខ្សែអក្សរ SMILES នៃអ៊ីសូហ្វមដោយប្រើ eLBOW នៅក្នុង PHENIX66។ ជាចុងក្រោយ គំរូត្រូវបានកែលម្អនៅក្នុងលំហពិតនៅក្នុង PHENIX ដោយប្រើការស្វែងរកក្រឡាចត្រង្គក្នុងស្រុក និងការបង្រួមអប្បបរមាសកលជាមួយនឹងការរឹតបន្តឹងរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំ។ ម៉ាស៊ីនមេ MolProbity ត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការកែលម្អគំរូ និងការវិភាគរចនាសម្ព័ន្ធ ហើយរូបភាពត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើ PyMOL និង UCSF Chimera X។ 67,68,69 ការវិភាគ Aperture ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើម៉ាស៊ីនមេ HOLE,70 និងការគូសផែនទីអភិរក្សលំដាប់ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើម៉ាស៊ីនមេ Consurf។71
ការវិភាគស្ថិតិត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើ Igor Pro 6.2, Excel Office 365 និង GraphPad Prism 7.0។ ទិន្នន័យបរិមាណទាំងអស់ត្រូវបានបង្ហាញជាមធ្យម ± កំហុសស្តង់ដារ (SEM)។ តេស្ត t របស់សិស្ស (ទ្វេភាគី មិនមានគូ) ត្រូវបានប្រើដើម្បីប្រៀបធៀបក្រុមពីរ។ ការវិភាគវ៉ារ្យង់មួយផ្លូវ (ANOVA) បន្ទាប់មកដោយតេស្ត post hoc របស់ Dunnett ត្រូវបានប្រើដើម្បីប្រៀបធៀបក្រុមច្រើន។ *P< ០,០៥, **ភី< ០,០១ និង ***P< 0.001 ត្រូវបានចាត់ទុកថាមានសារៈសំខាន់ខាងស្ថិតិអាស្រ័យលើការចែកចាយទិន្នន័យ។ តម្លៃ Kd, Ki និងចន្លោះជឿជាក់ 95% មិនស៊ីមេទ្រីរបស់វាត្រូវបានគណនាដោយប្រើ GraphPad Prism 10។
សម្រាប់ព័ត៌មានលម្អិតបន្ថែមអំពីវិធីសាស្រ្តសិក្សា សូមមើលសេចក្តីសង្ខេបរបាយការណ៍ផលប័ត្រធម្មជាតិដែលមានតំណភ្ជាប់នៅក្នុងអត្ថបទនេះ។
គំរូដំបូងត្រូវបានបង្កើតឡើងដោយប្រើប្រាស់គំរូកាល់ម៉ូឌូលីនពីមូលដ្ឋានទិន្នន័យ PDB 4JPZ និង 1CFD។ កូអរដោនេត្រូវបានរក្សាទុកនៅក្នុងធនាគារទិន្នន័យប្រូតេអ៊ីន (PDB) ក្រោមលេខចូលប្រើប្រាស់ 9NVN (Nan-Iav-CaM ដោយគ្មានលីហ្គែន) 9NVO (Nan-Iav-CaM ចងភ្ជាប់ទៅនឹងនីកូទីណាមីត) 9NVP (Nan-Iav-CaM ចងភ្ជាប់ទៅនឹងនីកូទីណាមីត និង EDTA) 9NVQ (Nan-Iav-CaM ចងភ្ជាប់ទៅនឹងអាហ្វេនីដូលភីរ៉ូលីន និងកាល់ស្យូម) 9NVR (Nan-Iav-CaM ចងភ្ជាប់ទៅនឹងអាហ្វេនីដូលភីរ៉ូលីន និង EDTA) និង 9NVS (Nan pentamer ចងភ្ជាប់ទៅនឹងអាហ្វេនីដូលភីរ៉ូលីន)។ រូបភាពមីក្រូទស្សន៍អេឡិចត្រុងត្រជាក់ដែលត្រូវគ្នាត្រូវបានរក្សាទុកនៅក្នុងមូលដ្ឋានទិន្នន័យមីក្រូទស្សន៍អេឡិចត្រុង (EMDB) ក្រោមលេខចូលប្រើប្រាស់ដូចខាងក្រោម៖ EMD-49844 (Nan-Iav-CaM ដោយគ្មានលីហ្គែន) EMD-49845 (ស្មុគស្មាញ Nan-Iav-CaM ជាមួយ nicotinamide) EMD-49846 (ស្មុគស្មាញ Nan-Iav-CaM ជាមួយ nicotinamide និង EDTA) EMD-49847 (ស្មុគស្មាញ Nan-Iav-CaM ជាមួយ aphidopyrrolline និងកាល់ស្យូម) EMD-49848 (ស្មុគស្មាញ Nan-Iav-CaM ជាមួយ aphidopyrrolline និង EDTA) និង EMD-49849 (ស្មុគស្មាញ Nan pentamer ជាមួយ aphidopyrrolline)។ ទិន្នន័យឆៅសម្រាប់ការវិភាគមុខងារត្រូវបានបង្ហាញនៅក្នុងឯកសារនេះ។
ពេលវេលាបង្ហោះ៖ ខែមករា-២៨-២០២៦