ថ្នាំសម្លាប់ព្រូន N,N-diethyl-m-toluamide (DEET) ត្រូវបានរាយការណ៍ថារារាំង AChE (អាសេទីលកូលីនអេស្តេរ៉ាស) និងមានលក្ខណៈសម្បត្តិបង្កមហារីកដោយសារតែការបង្កើតសរសៃឈាមច្រើនពេក។ នៅក្នុងឯកសារនេះ យើងបង្ហាញថា DEET ជំរុញជាពិសេសកោសិកា endothelial ដែលជំរុញការបង្កើតសរសៃឈាមឡើងវិញ ដោយហេតុនេះបង្កើនការលូតលាស់ដុំសាច់។ DEET ធ្វើឱ្យដំណើរការកោសិកាសកម្មដែលនាំឱ្យមានការបង្កើតសរសៃឈាមឡើងវិញ រួមទាំងការរីកសាយ ការធ្វើចំណាកស្រុក និងការស្អិតជាប់។ នេះត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងការកើនឡើងនៃការផលិត NO និងការបញ្ចេញមតិ VEGF នៅក្នុងកោសិកា endothelial។ ការបិទ M3 ឬការប្រើប្រាស់ថ្នាំទប់ស្កាត់ M3 ឱសថសាស្ត្របានលុបបំបាត់ផលប៉ះពាល់ទាំងអស់នេះ ដែលបង្ហាញថាការបង្កើតសរសៃឈាមឡើងវិញដែលបង្កឡើងដោយ DEET គឺងាយនឹង M3 ។ ការពិសោធន៍ដែលពាក់ព័ន្ធនឹងការផ្តល់សញ្ញាកាល់ស្យូមនៅក្នុងកោសិកា endothelial និង HEK ដែលបញ្ចេញមតិលើសកម្រិតនៃអ្នកទទួល M3 ក៏ដូចជាការសិក្សាអំពីការភ្ជាប់ និងការចត បង្ហាញថា DEET ដើរតួជាម៉ូឌុល allosteric នៃអ្នកទទួល M3 ។ លើសពីនេះ DEET រារាំង AChE ដោយហេតុនេះបង្កើនជីវសាស្រ្តនៃ acetylcholine និងការភ្ជាប់របស់វាទៅនឹងអ្នកទទួល M3 និងបង្កើនប្រសិទ្ធភាព proangiogenic តាមរយៈបទប្បញ្ញត្តិ allosteric ។
EC បឋមត្រូវបានញែកចេញពីសរសៃឈាមអាអ័រតារបស់កណ្ដុរស្វីស។ វិធីសាស្ត្រស្រង់ចេញត្រូវបានសម្របខ្លួនពីពិធីការ Kobayashi 26។ EC កណ្ដុរត្រូវបានដាំដុះនៅក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុក EBM-2 ដែលបានបន្ថែមជាមួយ FBS ដែលត្រូវបានធ្វើឱ្យអសកម្មដោយកំដៅ 5% រហូតដល់ការឆ្លងកាត់លើកទីបួន។
ឥទ្ធិពលនៃកំហាប់ពីរនៃ DEET លើការរីកសាយនៃ HUVEC, U87MG ឬ BF16F10 ត្រូវបានវិភាគដោយប្រើឧបករណ៍វិភាគការរីកសាយកោសិកា CyQUANT (ឧបករណ៍ស៊ើបអង្កេតម៉ូលេគុល, C7026)។ ជាសង្ខេប កោសិកាចំនួន 5.103 ក្នុងមួយអណ្តូងត្រូវបានសាបព្រោះក្នុងចាន 96 អណ្តូង អនុញ្ញាតឱ្យភ្ជាប់ពេញមួយយប់ ហើយបន្ទាប់មកព្យាបាលដោយ DEET រយៈពេល 24 ម៉ោង។ បន្ទាប់ពីយកឧបករណ៍ផ្ទុកលូតលាស់ចេញ សូមបន្ថែមដំណោះស្រាយចងថ្នាំជ្រលក់ទៅក្នុងអណ្តូងនីមួយៗនៃមីក្រូផ្លាត ហើយភ្ញាស់កោសិកានៅសីតុណ្ហភាព 37°C រយៈពេល 30 នាទី។ កម្រិតពន្លឺហ្វ្លុយអូរីសង់ត្រូវបានកំណត់ដោយប្រើឧបករណ៍អានមីក្រូផ្លាតពហុម៉ូដ Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, អាល្លឺម៉ង់) ដែលបំពាក់ដោយតម្រងរំញោច 485 nm និងតម្រងបំភាយ 530 nm។
HUVEC ត្រូវបានសាបព្រោះក្នុងចាន 96 រន្ធ ក្នុងដង់ស៊ីតេ 104 កោសិកាក្នុងមួយរន្ធ។ កោសិកាត្រូវបានព្យាបាលដោយ DEET រយៈពេល 24 ម៉ោង។ លទ្ធភាពរស់រានមានជីវិតកោសិកាត្រូវបានវាយតម្លៃដោយប្រើការវិភាគ MTT ពណ៌ (Sigma-Aldrich, M5655)។ តម្លៃដង់ស៊ីតេអុបទិកត្រូវបានទទួលនៅលើឧបករណ៍អានមីក្រូផ្លាតពហុម៉ូដ (Mithras LB940) នៅរលក 570 nm។
ផលប៉ះពាល់នៃ DEET ត្រូវបានសិក្សាដោយប្រើការវិភាគ angiogenesis ក្នុង vitro ។ ការព្យាបាលជាមួយ DEET 10-8 M ឬ 10-5 M បានបង្កើនការបង្កើតប្រវែងសរសៃឈាមតូចៗនៅក្នុង HUVECs (រូបភាពទី 1a, b របារពណ៌ស)។ បើប្រៀបធៀបជាមួយក្រុមត្រួតពិនិត្យ ការព្យាបាលជាមួយកំហាប់ DEET ចាប់ពី 10-14 ដល់ 10-5 M បានបង្ហាញថាប្រវែងសរសៃឈាមតូចៗបានឈានដល់កម្រិតខ្ពង់រាបនៅ DEET 10-8 M (រូបភាពបន្ថែម S2)។ មិនមានភាពខុសគ្នាគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៅក្នុងឥទ្ធិពល proangiogenic ក្នុង vitro នៃ HUVECs ដែលបានព្យាបាលជាមួយ DEET ក្នុងជួរកំហាប់ 10-8 M និង 10-5 M នោះទេ។
ដើម្បីកំណត់ឥទ្ធិពលរបស់ DEET ទៅលើការបង្កើតសរសៃឈាមថ្មី យើងបានធ្វើការសិក្សាអំពីការបង្កើតសរសៃឈាមថ្មីនៅក្នុងខ្លួន។ បន្ទាប់ពី 14 ថ្ងៃ កណ្ដុរដែលត្រូវបានចាក់កោសិកា endothelial ដែលដាំដុះជាមុនជាមួយ DEET 10-8 M ឬ 10-5 M បានបង្ហាញពីការកើនឡើងគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៃមាតិកាអេម៉ូក្លូប៊ីន (រូបភាពទី 1c របារពណ៌ស)។
លើសពីនេះ ការបង្កើតសរសៃឈាមថ្មីដែលបង្កឡើងដោយ DEET ត្រូវបានសិក្សាលើសត្វកណ្ដុរដែលមាន U87MG xenograft ដែលត្រូវបានចាក់ DEET ជារៀងរាល់ថ្ងៃ (ip) ក្នុងកម្រិតមួយដែលគេដឹងថាបង្កើតកំហាប់ប្លាស្មាពី 10-5 M ដែលជារឿងធម្មតាចំពោះមនុស្សដែលបានប៉ះពាល់។ ក្នុង 23. ដុំសាច់ដែលអាចរកឃើញ (ឧ. ដុំសាច់ >100 mm3) ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញ 14 ថ្ងៃបន្ទាប់ពីការចាក់កោសិកា U87MG ទៅក្នុងសត្វកណ្ដុរ។ នៅថ្ងៃទី 28 ការលូតលាស់ដុំសាច់ត្រូវបានបង្កើនគួរឱ្យកត់សម្គាល់ចំពោះសត្វកណ្ដុរដែលបានព្យាបាលដោយ DEET បើប្រៀបធៀបទៅនឹងសត្វកណ្ដុរត្រួតពិនិត្យ (រូបភាពទី 1d ការ៉េ)។ លើសពីនេះ ការជ្រលក់ពណ៌ CD31 នៃដុំសាច់បានបង្ហាញថា DEET បានបង្កើនផ្ទៃសរសៃឈាមតូចៗយ៉ាងច្រើន ប៉ុន្តែមិនមែនដង់ស៊ីតេសរសៃឈាមតូចៗទេ។ (រូបភាពទី 1e-g)។
ដើម្បីកំណត់តួនាទីរបស់អង់ស៊ីម muscarinic ក្នុងការរីកសាយដែលបង្កឡើងដោយ DETA, DETA 10-8 M ឬ 10-5 M នៅក្នុងវត្តមានរបស់ pFHHSiD (10-7 M ដែលជាអង់ទីករអង់ស៊ីម M3 ជ្រើសរើស) ត្រូវបានប្រើ។ ការព្យាបាល HUVEC។ pFHHSiD បានរារាំងទាំងស្រុងនូវលក្ខណៈសម្បត្តិរីកសាយរបស់ DETA នៅគ្រប់កំហាប់ទាំងអស់ (តារាងទី 1)។
ក្រោមលក្ខខណ្ឌទាំងនេះ យើងក៏បានពិនិត្យមើលថាតើ DEET នឹងបង្កើនប្រវែងសរសៃឈាមនៅក្នុងកោសិកា HUVEC ដែរឬទេ។ ស្រដៀងគ្នានេះដែរ pFHHSiD បានរារាំងប្រវែងសរសៃឈាមដែលបង្កឡើងដោយ DEET យ៉ាងសំខាន់ (រូបភាពទី 1a, b, របារពណ៌ប្រផេះ)។ លើសពីនេះ ការពិសោធន៍ស្រដៀងគ្នានេះត្រូវបានអនុវត្តជាមួយ M3 siRNA។ ទោះបីជា siRNA ត្រួតពិនិត្យមិនមានប្រសិទ្ធភាពក្នុងការជំរុញការបង្កើតសរសៃឈាមក៏ដោយ ការបិទសំឡេងរបស់ឧបករណ៍ទទួល muscarinic M3 បានលុបចោលសមត្ថភាពរបស់ DEET ក្នុងការបង្កើនប្រវែងសរសៃឈាម (រូបភាពទី 1a, b, របារពណ៌ខ្មៅ)។
លើសពីនេះ ទាំងការបង្កើតសរសៃឈាមដែលបង្កឡើងដោយ DEET 10-8 M ឬ 10-5 M នៅក្នុងវីត្រូ និងការបង្កើតសរសៃឈាមថ្មីនៅក្នុងវីវ៉ូ ត្រូវបានរារាំងទាំងស្រុងដោយ pFHHSiD (រូបភាពទី 1c, d, រង្វង់)។ លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថា DEET ជំរុញការបង្កើតសរសៃឈាមថ្មីតាមរយៈផ្លូវដែលងាយនឹងប្រតិកម្មទៅនឹងសារធាតុប្រឆាំងអង់ទីករ M3 ជ្រើសរើស ឬ M3 siRNA។
AChE គឺជាគោលដៅម៉ូលេគុលរបស់ DEET។ ថ្នាំដូចជា donepezil ដែលដើរតួជាថ្នាំទប់ស្កាត់ AChE អាចជំរុញ EC angiogenesis នៅក្នុង vitro និងនៅក្នុងគំរូ ischemia hindlimb កណ្ដុរ14។ យើងបានសាកល្បងឥទ្ធិពលនៃកំហាប់ពីរនៃ DEET ទៅលើសកម្មភាពអង់ស៊ីម AChE នៅក្នុង HUVEC។ កំហាប់ទាប (10-8 M) និងខ្ពស់ (10-5 M) នៃ DEET បានបន្ថយសកម្មភាព AChE endothelial បើប្រៀបធៀបទៅនឹងលក្ខខណ្ឌត្រួតពិនិត្យ (រូបភាពទី 2)។
កំហាប់ទាំងពីរនៃ DEET (10-8 M និង 10-5 M) បានកាត់បន្ថយសកម្មភាព acetylcholinesterase លើ HUVEC។ BW284c51 (10-5 M) ត្រូវបានប្រើជាការគ្រប់គ្រងសម្រាប់ថ្នាំទប់ស្កាត់ acetylcholinesterase។ លទ្ធផលត្រូវបានបង្ហាញជាភាគរយនៃសកម្មភាព AChE លើ HUVEC ដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយកំហាប់ទាំងពីរនៃ DEET បើប្រៀបធៀបទៅនឹងកោសិកាដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយយានយន្ត។ តម្លៃត្រូវបានបង្ហាញជាមធ្យម ± SEM នៃការពិសោធន៍ឯករាជ្យចំនួនប្រាំមួយ។ *p < 0.05 បើប្រៀបធៀបទៅនឹងការគ្រប់គ្រង (ការធ្វើតេស្តប្រៀបធៀបច្រើន Kruskal-Wallis និង Dunn)។
អុកស៊ីដអាសូត (NO) មានជាប់ពាក់ព័ន្ធនឹងដំណើរការបង្កើតសរសៃឈាម 33 ដូច្នេះការផលិត NO នៅក្នុង HUVECs ដែលជំរុញដោយ DEET ត្រូវបានសិក្សា។ ការផលិត NO endothelial ដែលព្យាបាលដោយ DEET ត្រូវបានកើនឡើងបើប្រៀបធៀបទៅនឹងកោសិកាត្រួតពិនិត្យ ប៉ុន្តែឈានដល់សារៈសំខាន់តែនៅកម្រិត 10-8 M (រូបភាពទី 3c)។ ដើម្បីកំណត់ការផ្លាស់ប្តូរម៉ូលេគុលដែលគ្រប់គ្រងការផលិត NO ដែលបង្កឡើងដោយ DEET ការបញ្ចេញមតិ និងការធ្វើឱ្យសកម្មរបស់ eNOS ត្រូវបានវិភាគដោយ Western blotting។ ទោះបីជាការព្យាបាលដោយ DEET មិនបានផ្លាស់ប្តូរការបញ្ចេញមតិ eNOS ក៏ដោយ វាបានបង្កើនការផូស្វ័រ eNOS យ៉ាងសំខាន់នៅកន្លែងធ្វើឱ្យសកម្មរបស់វា (Ser-1177) ខណៈពេលដែលបន្ថយកន្លែងរារាំងរបស់វា (Thr-495) បើប្រៀបធៀបទៅនឹងកោសិកាដែលមិនបានព្យាបាលនៅក្នុង phosphorylation eNOS (រូបភាពទី 3d)។ លើសពីនេះ សមាមាត្រនៃ eNOS ដែលផូស្វ័រនៅកន្លែងធ្វើឱ្យសកម្ម និងកន្លែងរារាំងត្រូវបានគណនាបន្ទាប់ពីធ្វើឱ្យបរិមាណ eNOS ដែលផូស្វ័រមានលក្ខណៈធម្មតាទៅនឹងបរិមាណសរុបនៃអង់ស៊ីម។ សមាមាត្រនេះត្រូវបានកើនឡើងគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៅក្នុង HUVECs ដែលបានព្យាបាលដោយកំហាប់នីមួយៗនៃ DEET បើប្រៀបធៀបទៅនឹងកោសិកាដែលមិនបានព្យាបាល (រូបភាពទី 3d)។
ជាចុងក្រោយ ការបញ្ចេញមតិរបស់ VEGF ដែលជាកត្តាជំរុញសរសៃឈាមដ៏សំខាន់មួយ ត្រូវបានវិភាគដោយវិធីសាស្ត្រ Western blotting។ DEET បានបង្កើនការបញ្ចេញមតិ VEGF យ៉ាងខ្លាំង ខណៈដែល pFHHSiD បានរារាំងការបញ្ចេញមតិនេះទាំងស្រុង។
ដោយសារតែឥទ្ធិពលរបស់ DEET ងាយនឹងរងផលប៉ះពាល់ទាំងការរារាំងឱសថសាស្ត្រ និងការថយចុះនៃអ្នកទទួល M3 យើងបានសាកល្បងសម្មតិកម្មដែលថា DEET អាចបង្កើនការបញ្ជូនសញ្ញាកាល់ស្យូម។ គួរឱ្យភ្ញាក់ផ្អើល DEET បានបរាជ័យក្នុងការបង្កើនកាល់ស្យូមស៊ីតូប្លាស្មិកនៅក្នុង HUVEC (ទិន្នន័យមិនត្រូវបានបង្ហាញ) និង HEK/M3 (រូបភាពទី 4a, ខ) សម្រាប់កំហាប់ទាំងពីរដែលបានប្រើ។
ពេលវេលាបង្ហោះ៖ ថ្ងៃទី 30 ខែធ្នូ ឆ្នាំ 2024