ថ្នាំ anthelmintic N, N-diethyl-m-toluamide (DEET) ត្រូវបានគេរាយការណ៍ថារារាំង AChE (acetylcholinesterase) និងមានលក្ខណៈសម្បត្តិបង្កមហារីកដោយសារការបំប្លែងសរសៃឈាមច្រើនពេក។ នៅក្នុងក្រដាសនេះ យើងបង្ហាញថា DEET ពិសេសជំរុញកោសិកា endothelial ដែលជំរុញការបង្កើត angiogenesis ដោយហេតុនេះបង្កើនការលូតលាស់ដុំសាច់។ DEET ធ្វើឱ្យដំណើរការកោសិកាដែលនាំទៅដល់ការកើតជម្ងឺ angiogenesis រួមទាំងការរីកសាយ ការធ្វើចំណាកស្រុក និងការស្អិត។ នេះត្រូវបានផ្សារភ្ជាប់ជាមួយនឹងការបង្កើនការផលិត NO និងការបញ្ចេញ VEGF នៅក្នុងកោសិកា endothelial ។ ការស្ងៀមស្ងាត់នៃ M3 ឬការប្រើប្រាស់ថ្នាំទប់ស្កាត់ M3 ឱសថសាស្រ្តបានលុបចោលនូវផលប៉ះពាល់ទាំងអស់នេះ ដោយបង្ហាញថា DEET-induced angiogenesis គឺ M3-sensitive។ ការពិសោធន៍ដែលពាក់ព័ន្ធនឹងសញ្ញាជាតិកាល់ស្យូមនៅក្នុងកោសិកា endothelial និង HEK ដែលបង្ហាញពីការទទួល M3 ហួសប្រមាណ ក៏ដូចជាការសិក្សាចងភ្ជាប់ និងចូលចត បង្ហាញថា DEET ដើរតួជាម៉ូលេគុល allosteric នៃអ្នកទទួល M3 ។ លើសពីនេះទៀត DEET រារាំង AChE ដោយហេតុនេះបង្កើនភាពអាចរកបាននៃជីវសាស្រ្តនៃ acetylcholine និងការផ្សារភ្ជាប់របស់វាទៅនឹងអ្នកទទួល M3 និងបង្កើនឥទ្ធិពល proangiogenic តាមរយៈបទប្បញ្ញត្តិ allosteric ។
ECs បឋមត្រូវបានញែកចេញពី aorta នៃសត្វកណ្ដុរស្វីស។ វិធីសាស្ត្រស្រង់ចេញត្រូវបានកែសម្រួលពីពិធីការ Kobayashi 26 ។ Murine ECs ត្រូវបានដាំដុះនៅក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុក EBM-2 ដែលត្រូវបានបន្ថែមដោយ FBS ដែលមិនដំណើរការដោយកំដៅ 5% រហូតដល់វគ្គទី 4 ។
ឥទ្ធិពលនៃការប្រមូលផ្តុំពីរនៃ DEET លើការរីកសាយនៃ HUVEC, U87MG, ឬ BF16F10 ត្រូវបានវិភាគដោយប្រើ CyQUANT Cell Proliferation Assay Assay Kit (Molecular Probes, C7026)។ ដោយសង្ខេប កោសិកាចំនួន 5.103 ក្នុងមួយអណ្តូងត្រូវបានបណ្តុះក្នុងចានអណ្តូង 96 ដែលត្រូវបានអនុញ្ញាតឱ្យភ្ជាប់ពេញមួយយប់ ហើយបន្ទាប់មកព្យាបាលដោយ DEET រយៈពេល 24 ម៉ោង។ បនា្ទាប់ពីដកឧបករណ៍ផ្ទុកលូតលាស់រួច បន្ថែមសូលុយស្យុងចងថ្នាំជ្រលក់ទៅក្នុងអណ្តូងនីមួយៗនៃមីក្រូប្លាត និងភ្ញាស់កោសិកានៅសីតុណ្ហភាព 37 អង្សាសេរយៈពេល 30 នាទី។ កម្រិតហ្វ្លុយអូរីសត្រូវបានកំណត់ដោយប្រើឧបករណ៍អានមីក្រូប្លាតពហុម៉ូដ Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany) បំពាក់ដោយតម្រងរំភើប 485 nm និងតម្រងបំភាយ 530 nm ។
HUVEC ត្រូវបានគេបណ្ដុះក្នុងចានអណ្តូង ៩៦ នៅដង់ស៊ីតេ ១០៤ កោសិកាក្នុងមួយអណ្តូង។ កោសិកាត្រូវបានព្យាបាលដោយ DEET រយៈពេល 24 ម៉ោង។ លទ្ធភាពជោគជ័យរបស់កោសិកាត្រូវបានវាយតម្លៃដោយប្រើ colorimetric assay MTT (Sigma-Aldrich, M5655)។ តម្លៃដង់ស៊ីតេអុបទិកត្រូវបានទទួលនៅលើឧបករណ៍អានមីក្រូពហុម៉ូដ (Mithras LB940) នៅរលកនៃ 570 nm ។
ផលប៉ះពាល់នៃ DEET ត្រូវបានគេសិក្សាដោយប្រើការវិភាគ in vitro angiogenesis ។ ការព្យាបាលដោយប្រើ 10-8 M ឬ 10-5 M DEET បានបង្កើនការបង្កើតប្រវែង capillary នៅក្នុង HUVECs (រូបភាព 1a, b, white bars) ។ បើប្រៀបធៀបជាមួយនឹងក្រុមត្រួតពិនិត្យ ការព្យាបាលជាមួយនឹងកំហាប់ DEET ចាប់ពី 10-14 ដល់ 10-5 M បានបង្ហាញថាប្រវែង capillary ឈានដល់ខ្ពង់រាបនៅ 10-8 M DEET (រូបភាពបន្ថែម S2) ។ មិនមានភាពខុសគ្នាខ្លាំងត្រូវបានគេរកឃើញនៅក្នុងឥទ្ធិពល in vitro proangiogenic នៃ HUVECs ដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ DEET ក្នុងកម្រិតកំហាប់នៃ 10-8 M និង 10-5 M ។
ដើម្បីកំណត់ពីឥទ្ធិពលនៃ DEET លើ neovascularization យើងបានអនុវត្តនៅក្នុងការសិក្សា vivo neovascularization ។ បន្ទាប់ពី 14 ថ្ងៃ សត្វកណ្ដុរដែលចាក់បញ្ចូលកោសិកា endothelial precultured ជាមួយ 10-8 M ឬ 10-5 M DEET បានបង្ហាញពីការកើនឡើងយ៉ាងខ្លាំងនៃមាតិកាអេម៉ូក្លូប៊ីន (រូបភាព 1c, របារពណ៌ស) ។
លើសពីនេះ ការធ្វើសរសៃសរសៃប្រសាទដែលបណ្ដាលមកពី DEET ត្រូវបានសិក្សាលើសត្វកណ្តុរ U87MG xenograft-bearing ដែលត្រូវបានចាក់ជារៀងរាល់ថ្ងៃ (ip) ជាមួយ DEET ក្នុងកម្រិតមួយដែលគេដឹងថាអាចជំរុញការប្រមូលផ្តុំប្លាស្មានៃ 10-5 M ដែលជារឿងធម្មតានៅក្នុងមនុស្សដែលប៉ះពាល់។ ក្នុង 23. ដុំសាច់ដែលអាចរកឃើញ (ឧទាហរណ៍ ដុំសាច់> 100 mm3) ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញ 14 ថ្ងៃបន្ទាប់ពីការចាក់បញ្ចូលកោសិកា U87MG ទៅក្នុងសត្វកណ្តុរ។ នៅថ្ងៃទី 28 ការលូតលាស់ដុំសាច់ត្រូវបានពង្រឹងយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុងសត្វកណ្តុរដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ DEET បើប្រៀបធៀបជាមួយសត្វកណ្តុរគ្រប់គ្រង (រូបភាពទី 1 ឃ ការ៉េ)។ លើសពីនេះ ស្នាមប្រឡាក់ CD31 នៃដុំសាច់បានបង្ហាញថា DEET កើនឡើងយ៉ាងខ្លាំងនូវតំបន់ capillary ប៉ុន្តែមិនមែនដង់ស៊ីតេ microvessel នោះទេ។ (រូបភាព 1e–g) ។
ដើម្បីកំណត់តួនាទីរបស់អ្នកទទួល muscarinic ក្នុងការរីកសាយដែលបណ្តាលមកពី DETA, 10-8 M ឬ 10-5 M DETA នៅក្នុងវត្តមានរបស់ pFHHSiD (10-7 M, a selective M3 receptor antagonist) ត្រូវបានគេប្រើ។ ការព្យាបាល HUVEC ។ pFHHSiD បានទប់ស្កាត់ទាំងស្រុងនូវលក្ខណៈសម្បត្តិរីកសាយនៃ DETA នៅគ្រប់ការប្រមូលផ្តុំ (តារាងទី 1)។
នៅក្រោមលក្ខខណ្ឌទាំងនេះ យើងក៏បានពិនិត្យមើលថាតើ DEET នឹងបង្កើនប្រវែង capillary នៅក្នុងកោសិកា HUVEC ដែរឬទេ។ ស្រដៀងគ្នានេះដែរ pFHHSiD បានទប់ស្កាត់យ៉ាងខ្លាំងនូវប្រវែង capillary ដែលបណ្តាលមកពី DEET (រូបភាព 1a, b, របារពណ៌ប្រផេះ)។ លើសពីនេះទៀតការពិសោធន៍ស្រដៀងគ្នាត្រូវបានអនុវត្តជាមួយ M3 siRNA ។ ទោះបីជា siRNA វត្ថុបញ្ជាមិនមានប្រសិទ្ធភាពក្នុងការលើកកម្ពស់ការបង្កើត capillary ក៏ដោយ ការបិទមាត់របស់ M3 muscarinic receptor បានលុបចោលនូវសមត្ថភាពរបស់ DEET ដើម្បីបង្កើនប្រវែង capillary (រូបភាព 1a, b, black bars)។
លើសពីនេះ ទាំង 10-8 M ឬ 10-5 M DEET-induced vascularization in vitro និង neovascularization in vivo ត្រូវបានរារាំងទាំងស្រុងដោយ pFHHSiD (រូបភាព 1c, d, circles)។ លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថា DEET លើកកម្ពស់ការកើតជម្ងឺ angiogenesis តាមរយៈផ្លូវរសើបចំពោះអ្នកជ្រើសរើស M3 receptor antagonists ឬ M3 siRNA ។
AChE គឺជាគោលដៅម៉ូលេគុលរបស់ DEET ។ ឱសថដូចជា ដូប៉េហ្សីល ដែលដើរតួជាថ្នាំទប់ស្កាត់ AChE អាចជំរុញ EC angiogenesis in vitro និង in mouse hindlimb ischemia model14 ។ យើងបានសាកល្បងប្រសិទ្ធភាពនៃការប្រមូលផ្តុំពីរនៃ DEET លើសកម្មភាពអង់ស៊ីម AChE នៅក្នុង HUVEC ។ កម្រិតទាប (10-8 M) និងខ្ពស់ (10-5 M) នៃ DEET ថយចុះសកម្មភាព endothelial AChE បើប្រៀបធៀបទៅនឹងលក្ខខណ្ឌត្រួតពិនិត្យ (រូបភាពទី 2) ។
ការប្រមូលផ្តុំទាំងពីរនៃ DEET (10-8 M និង 10-5 M) បានកាត់បន្ថយសកម្មភាព acetylcholinesterase នៅលើ HUVEC ។ BW284c51 (10-5 M) ត្រូវបានគេប្រើជាការគ្រប់គ្រងសម្រាប់ acetylcholinesterase inhibitors ។ លទ្ធផលត្រូវបានបង្ហាញជាភាគរយនៃសកម្មភាព AChE នៅលើ HUVEC ដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយកំហាប់ពីរនៃ DEET បើប្រៀបធៀបទៅនឹងកោសិកាដែលព្យាបាលដោយយានយន្ត។ តម្លៃត្រូវបានបង្ហាញជាមធ្យម± SEM នៃការពិសោធន៍ឯករាជ្យចំនួនប្រាំមួយ។ *p < 0.05 ប្រៀបធៀបទៅនឹងការគ្រប់គ្រង (ការធ្វើតេស្តប្រៀបធៀបច្រើន Kruskal-Wallis និង Dunn) ។
នីទ្រីកអុកស៊ីដ (NO) ត្រូវបានចូលរួមនៅក្នុងដំណើរការ angiogenic 33 ដូច្នេះគ្មានការផលិតនៅក្នុង HUVECs ដែលជំរុញដោយ DEET ត្រូវបានសិក្សាទេ។ ការផលិត endothelial NO ដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ DEET ត្រូវបានកើនឡើងបើប្រៀបធៀបទៅនឹងកោសិកាគ្រប់គ្រង ប៉ុន្តែបានឈានដល់សារៈសំខាន់តែក្នុងកម្រិត 10-8 M (រូបភាព 3c) ប៉ុណ្ណោះ។ ដើម្បីកំណត់ការផ្លាស់ប្តូរម៉ូលេគុលដែលគ្រប់គ្រង DEET-induced NO production, eNOS expression and activation ត្រូវបានវិភាគដោយការ blotting លោកខាងលិច។ ទោះបីជាការព្យាបាលដោយ DEET មិនបានផ្លាស់ប្តូរការបញ្ចេញមតិ eNOS ក៏ដោយ វាបានបង្កើនយ៉ាងខ្លាំងនូវ eNOS phosphorylation នៅកន្លែងសកម្មរបស់វា (Ser-1177) ខណៈពេលដែលបន្ថយទីតាំង inhibitory របស់វា (Thr-495) បើប្រៀបធៀបទៅនឹងកោសិកាដែលមិនបានព្យាបាលនៅក្នុង eNOS phosphorylation (រូបភាព 3d)។ លើសពីនេះទៀតសមាមាត្រនៃ phosphorylated eNOS នៅកន្លែងធ្វើឱ្យសកម្មនិងកន្លែងរារាំងត្រូវបានគណនាបន្ទាប់ពីការធ្វើឱ្យធម្មតានៃបរិមាណ phosphorylated eNOS ទៅនឹងបរិមាណសរុបនៃអង់ស៊ីម។ សមាមាត្រនេះត្រូវបានកើនឡើងយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុង HUVECs ដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយការផ្តោតអារម្មណ៍នីមួយៗនៃ DEET បើប្រៀបធៀបទៅនឹងកោសិកាដែលមិនបានព្យាបាល (រូបភាព 3d) ។
ទីបំផុតការបញ្ចេញមតិនៃ VEGF ដែលជាកត្តា proangiogenic ដ៏សំខាន់មួយត្រូវបានវិភាគដោយការ blotting លោកខាងលិច។ DEET បានបង្កើនការបញ្ចេញមតិ VEGF យ៉ាងខ្លាំង ចំណែក pFHHSiD បានរារាំងកន្សោមនេះទាំងស្រុង។
ដោយសារឥទ្ធិពលនៃ DEET មានភាពរសើបចំពោះទាំងការទប់ស្កាត់ឱសថសាស្ត្រ និងការថយចុះនៃអ្នកទទួល M3 យើងបានសាកល្បងសម្មតិកម្មដែលថា DEET អាចបង្កើនសញ្ញាជាតិកាល់ស្យូម។ គួរឱ្យភ្ញាក់ផ្អើល DEET បានបរាជ័យក្នុងការបង្កើនជាតិកាល់ស្យូម cytoplasmic នៅក្នុង HUVEC (ទិន្នន័យមិនបានបង្ហាញ) និង HEK/M3 (រូបភាព 4a, ខ) សម្រាប់ការប្រមូលផ្តុំទាំងពីរដែលបានប្រើ។
ពេលវេលាប្រកាស៖ ថ្ងៃទី ៣០ ខែធ្នូ ឆ្នាំ ២០២៤