ឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាជីវសាស្ត្រជីបប៊ែររ៉េលីនបរិមាណបង្ហាញពីតួនាទីរបស់ជីបប៊ែររ៉េលីនក្នុងការបញ្ជាក់លក្ខណៈអន្តរណូតនៅក្នុងមេរីស្ទីមកំពូលនៃពន្លក

ការលូតលាស់​នៃ​មេរីស្ទីម​ចុង​ពន្លក (SAM) គឺ​មាន​សារៈសំខាន់​ណាស់​សម្រាប់​ស្ថាបត្យកម្ម​ដើម។ អរម៉ូន​រុក្ខជាតិជីបប៊ែរលីន(GAs) ដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់ក្នុងការសម្របសម្រួលការលូតលាស់របស់រុក្ខជាតិ ប៉ុន្តែតួនាទីរបស់ពួកវានៅក្នុង SAM នៅតែមិនទាន់យល់ច្បាស់នៅឡើយ។ នៅទីនេះ យើងបានបង្កើតជីវឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាសមាមាត្រនៃការបញ្ជូនសញ្ញា GA ដោយវិស្វកម្មប្រូតេអ៊ីន DELLA ដើម្បីទប់ស្កាត់មុខងារនិយតកម្មដ៏សំខាន់របស់វានៅក្នុងការឆ្លើយតបប្រតិចារិក GA ខណៈពេលដែលរក្សាការរិចរិលរបស់វានៅពេលទទួលស្គាល់ GA។ យើងបង្ហាញថា ជីវឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាដែលមានមូលដ្ឋានលើការរិចរិលនេះកត់ត្រាការផ្លាស់ប្តូរយ៉ាងត្រឹមត្រូវនៅក្នុងកម្រិត GA និងការចាប់សញ្ញាកោសិកាក្នុងអំឡុងពេលអភិវឌ្ឍន៍។ យើងបានប្រើជីវឧបករណ៍ចាប់សញ្ញានេះដើម្បីគូសផែនទីសកម្មភាពបញ្ជូនសញ្ញា GA នៅក្នុង SAM។ យើងបង្ហាញថា សញ្ញា GA ខ្ពស់មានវត្តមានជាចម្បងនៅក្នុងកោសិកាដែលមានទីតាំងនៅចន្លោះសរីរាង្គបឋម ដែលជាបុព្វបទនៃកោសិកាអន្តរណូត។ ដោយប្រើវិធីសាស្រ្តទទួលបាន និងបាត់បង់មុខងារ យើងបង្ហាញបន្ថែមទៀតថា GA គ្រប់គ្រងទិសដៅនៃប្លង់បែងចែកកោសិកា ដោយបង្កើតអង្គការកោសិកាធម្មតានៃអន្តរណូត ដោយហេតុនេះលើកកម្ពស់ការបញ្ជាក់អន្តរណូតនៅក្នុង SAM។
មេរីស្ទីម​ចុង​ពន្លក (SAM) ដែលមានទីតាំងនៅចុងពន្លក មានកោសិកាដើមជាច្រើនដែលសកម្មភាពរបស់វាបង្កើតសរីរាង្គចំហៀង និងថ្នាំងដើមក្នុងលក្ខណៈម៉ូឌុល និងដដែលៗពេញមួយជីវិតរបស់រុក្ខជាតិ។ ឯកតាដដែលៗនីមួយៗ ឬថ្នាំងរុក្ខជាតិ រួមមាន ចន្លោះថ្នាំង និងសរីរាង្គចំហៀងនៅថ្នាំង និងមេរីស្ទីមក្លៀកនៅក្នុងក្លៀកស្លឹក1។ ការលូតលាស់ និងការរៀបចំថ្នាំងរុក្ខជាតិផ្លាស់ប្តូរក្នុងអំឡុងពេលអភិវឌ្ឍន៍។ នៅក្នុង Arabidopsis ការលូតលាស់រវាងថ្នាំងត្រូវបានបង្ក្រាបក្នុងដំណាក់កាលលូតលាស់ ហើយមេរីស្ទីមក្លៀកនៅតែអសកម្មនៅក្នុងក្លៀកស្លឹកផ្កាកុលាប។ ក្នុងអំឡុងពេលផ្លាស់ប្តូរទៅដំណាក់កាលចេញផ្កា SAM ក្លាយជាមេរីស្ទីមផ្កា បង្កើតចន្លោះថ្នាំង និងពន្លកក្លៀក មែកតូចៗនៅក្នុងក្លៀកស្លឹកផ្កាខាត់ណាខៀវ និងក្រោយមកផ្កាគ្មានស្លឹក2។ ទោះបីជាយើងបានធ្វើឱ្យមានវឌ្ឍនភាពគួរឱ្យកត់សម្គាល់ក្នុងការយល់ដឹងអំពីយន្តការដែលគ្រប់គ្រងការចាប់ផ្តើមនៃស្លឹក ផ្កា និងមែកឈើក៏ដោយ ក៏មានការដឹងតិចតួចណាស់អំពីរបៀបដែលចន្លោះថ្នាំងកើតឡើង។
ការយល់ដឹងអំពីការចែកចាយលំហ និងពេលវេលារបស់ GAs នឹងជួយយល់កាន់តែច្បាស់អំពីមុខងាររបស់អរម៉ូនទាំងនេះនៅក្នុងជាលិកាផ្សេងៗគ្នា និងនៅដំណាក់កាលអភិវឌ្ឍន៍ផ្សេងៗគ្នា។ ការមើលឃើញនៃការរិចរិលនៃការលាយបញ្ចូលគ្នា RGA-GFP ដែលបង្ហាញក្រោមសកម្មភាពរបស់ប្រូម៉ូទ័ររបស់វាផ្តល់នូវព័ត៌មានសំខាន់ៗអំពីបទប្បញ្ញត្តិនៃកម្រិត GA សរុបនៅក្នុងឫស15,16។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការបញ្ចេញមតិ RGA ប្រែប្រួលនៅទូទាំងជាលិកា17 ហើយត្រូវបានគ្រប់គ្រងដោយ GA18។ ដូច្នេះ ការបញ្ចេញមតិឌីផេរ៉ង់ស្យែលនៃប្រូម៉ូទ័រ RGA អាចបណ្តាលឱ្យមានលំនាំ fluorescence ដែលសង្កេតឃើញជាមួយ RGA-GFP ហើយដូច្នេះវិធីសាស្ត្រនេះមិនមែនជាបរិមាណទេ។ ថ្មីៗនេះ GA19,20 ដែលមានស្លាក fluorescein (Fl) សកម្មបានបង្ហាញពីការប្រមូលផ្តុំ GA នៅក្នុង endocortex ឫស និងបទប្បញ្ញត្តិនៃកម្រិតកោសិការបស់វាដោយការដឹកជញ្ជូន GA។ ថ្មីៗនេះ ឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា GA FRET nlsGPS1 បានបង្ហាញថាកម្រិត GA មានទំនាក់ទំនងជាមួយការលាតសន្ធឹងកោសិកានៅក្នុងឫស ខ្សែស្រឡាយ និង hypocotyls ដែលលូតលាស់ងងឹត21។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ដូចដែលយើងបានឃើញ កំហាប់ GA មិនមែនជាប៉ារ៉ាម៉ែត្រតែមួយគត់ដែលគ្រប់គ្រងសកម្មភាពសញ្ញា GA នោះទេ ព្រោះវាអាស្រ័យលើដំណើរការចាប់សញ្ញាស្មុគស្មាញ។ នៅទីនេះ ដោយ​ផ្អែក​លើ​ការ​យល់​ដឹង​របស់​យើង​អំពី​ផ្លូវ​សញ្ញា DELLA និង GA យើង​រាយការណ៍​ពី​ការ​អភិវឌ្ឍ និង​ការ​កំណត់​លក្ខណៈ​នៃ​ជីវឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា​សមាមាត្រ​ដែល​ផ្អែក​លើ​ការ​រិចរិល​សម្រាប់​សញ្ញា GA។ ដើម្បី​អភិវឌ្ឍ​ជីវឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា​បរិមាណ​នេះ យើង​បាន​ប្រើ RGA ដែល​ងាយ​រង​ឥទ្ធិពល​ពី GA ដែល​បាន​ផ្លាស់ប្តូរ ដែល​ត្រូវ​បាន​បញ្ចូល​ទៅ​ក្នុង​ប្រូតេអ៊ីន fluorescent និង​ត្រូវ​បាន​បង្ហាញ​ជា​សកល​នៅ​ក្នុង​ជាលិកា ក៏ដូចជា​ប្រូតេអ៊ីន fluorescent ដែល​មិន​ងាយ​រង​ឥទ្ធិពល​ពី GA។ យើង​បង្ហាញ​ថា ការ​រួម​បញ្ចូល​ប្រូតេអ៊ីន RGA ដែល​បាន​ផ្លាស់ប្តូរ​មិន​ជ្រៀតជ្រែក​ជាមួយ​នឹង​សញ្ញា GA ដែល​កើត​ចេញ​ពី​កំណើត​ទេ នៅពេល​ដែល​ត្រូវ​បាន​បង្ហាញ​ជា​សកល ហើយ​ជីវឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា​នេះ​អាច​វាស់​បរិមាណ​សកម្មភាព​សញ្ញា​ដែល​ជា​លទ្ធផល​នៃ​ការ​បញ្ចូល GA និង​ដំណើរការ​សញ្ញា GA ដោយ​ឧបករណ៍​ចាប់សញ្ញា​ដែល​មាន​គុណភាព​បង្ហាញ​លំហ​ពេលវេលា​ខ្ពស់។ យើង​បាន​ប្រើ​ជីវឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា​នេះ​ដើម្បី​គូសផែនទី​ការ​ចែកចាយ​លំហ​ពេលវេលា​នៃ​សកម្មភាព​សញ្ញា GA និង​វាស់​បរិមាណ​របៀប​ដែល GA គ្រប់គ្រង​ឥរិយាបថ​កោសិកា​នៅ​ក្នុង​ស្រទាប់​ខាងក្រៅ SAM។ យើង​បង្ហាញ​ថា GA គ្រប់គ្រង​ទិស​នៃ​ប្លង់​បែងចែក​កោសិកា SAM ដែល​មាន​ទីតាំង​នៅ​ចន្លោះ​សរីរាង្គ primordia ដោយហេតុនេះ​កំណត់​អង្គការ​កោសិកា​ធម្មតា​នៃ internode។
ជាចុងក្រោយ យើងបានសួរថាតើ qmRGA អាចរាយការណ៍ពីការផ្លាស់ប្តូរកម្រិត GA ខាងក្នុងដោយប្រើអ៊ីប៉ូកូទីលដែលកំពុងលូតលាស់បានដែរឬទេ។ ពីមុនយើងបានបង្ហាញថា នីត្រាតជំរុញការលូតលាស់ដោយបង្កើនការសំយោគ GA ហើយជាលទ្ធផល ការរិចរិល DELLA34។ ដូច្នោះហើយ យើងបានសង្កេតឃើញថា ប្រវែងអ៊ីប៉ូកូទីលនៅក្នុងសំណាប pUBQ10::qmRGA ដែលដាំដុះក្រោមការផ្គត់ផ្គង់នីត្រាតច្រើន (10 mM NO3−) គឺវែងជាងសំណាបដែលដាំដុះក្រោមលក្ខខណ្ឌខ្វះនីត្រាត (រូបភាពបន្ថែម 6a)។ ស្របនឹងការឆ្លើយតបនៃការលូតលាស់ សញ្ញា GA គឺខ្ពស់ជាងនៅក្នុងអ៊ីប៉ូកូទីលនៃសំណាបដែលដាំដុះក្រោមលក្ខខណ្ឌ 10 mM NO3− ជាងសំណាបដែលដាំដុះក្នុងអវត្តមាននៃនីត្រាត (រូបភាពបន្ថែម 6b, c)។ ដូច្នេះ qmRGA ក៏អនុញ្ញាតឱ្យមានការតាមដានការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុងសញ្ញា GA ដែលបង្កឡើងដោយការផ្លាស់ប្តូរខាងក្នុងនៅក្នុងកំហាប់ GA។
ដើម្បីយល់ថាតើសកម្មភាពសញ្ញា GA ដែលរកឃើញដោយ qmRGA អាស្រ័យលើកំហាប់ GA និងការយល់ឃើញ GA ដូចដែលរំពឹងទុកដោយផ្អែកលើការរចនាឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា យើងបានវិភាគការបញ្ចេញមតិរបស់អង់តែន GID1 ទាំងបីនៅក្នុងជាលិកាលូតលាស់ និងជាលិកាបន្តពូជ។ នៅក្នុងសំណាប ខ្សែអ្នករាយការណ៍ GID1-GUS បានបង្ហាញថា GID1a និង c ត្រូវបានបង្ហាញយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុងស្លឹកស្លឹក (រូបភាពទី 3a-c)។ លើសពីនេះ អង់តែនទាំងបីត្រូវបានបង្ហាញនៅក្នុងស្លឹក ឫស primordia ចំហៀង ចុងឫស (លើកលែងតែមួកឫសរបស់ GID1b) និងប្រព័ន្ធសរសៃឈាម (រូបភាពទី 3a-c)។ នៅក្នុង SAM នៃផ្កា យើងបានរកឃើញសញ្ញា GUS សម្រាប់តែ GID1b និង 1c ប៉ុណ្ណោះ (រូបភាពបន្ថែម 7a-c)។ ការបង្កាត់ពូជនៅនឹងកន្លែងបានបញ្ជាក់ពីគំរូការបញ្ចេញមតិទាំងនេះ និងបានបង្ហាញបន្ថែមទៀតថា GID1c ត្រូវបានបង្ហាញស្មើៗគ្នានៅកម្រិតទាបនៅក្នុង SAM ខណៈដែល GID1b បានបង្ហាញពីការបញ្ចេញមតិខ្ពស់ជាងនៅបរិវេណនៃ SAM (រូបភាពបន្ថែម 7d-l)។ ការលាយបញ្ចូលគ្នានៃការបកប្រែ pGID1b::2xmTQ2-GID1b ក៏បានបង្ហាញពីជួរនៃការបញ្ចេញមតិ GID1b ដែលមានកម្រិតផងដែរ ចាប់ពីការបញ្ចេញមតិទាប ឬគ្មាននៅចំកណ្តាលនៃ SAM រហូតដល់ការបញ្ចេញមតិខ្ពស់នៅព្រំដែនសរីរាង្គ (រូបភាពបន្ថែម 7m)។ ដូច្នេះ អ្នកទទួល GID1 មិនត្រូវបានចែកចាយស្មើៗគ្នានៅទូទាំង និងក្នុងជាលិកាទេ។ នៅក្នុងការពិសោធន៍ជាបន្តបន្ទាប់ យើងក៏បានសង្កេតឃើញថា ការបញ្ចេញមតិលើសកម្រិតនៃ GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) បានបង្កើនភាពរសើបនៃ qmRGA នៅក្នុង hypocotyls ចំពោះការអនុវត្ត GA ខាងក្រៅ (រូបភាពទី 3d, e)។ ផ្ទុយទៅវិញ ការបញ្ចេញពន្លឺដែលវាស់ដោយ qd17mRGA នៅក្នុង hypocotyl គឺមិនងាយនឹងទទួលការព្យាបាលដោយ GA3 (រូបភាពទី 3f, g)។ សម្រាប់ការវាស់វែងទាំងពីរ សំណាបត្រូវបានព្យាបាលដោយកំហាប់ខ្ពស់នៃ GA (100 μM GA3) ដើម្បីវាយតម្លៃឥរិយាបថរហ័សរបស់ឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា ដែលសមត្ថភាពក្នុងការភ្ជាប់ទៅនឹងអ្នកទទួល GID1 ត្រូវបានបង្កើន ឬបាត់បង់។ លទ្ធផលទាំងនេះរួមគ្នាបញ្ជាក់ថា ជីវឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា qmRGA បម្រើមុខងាររួមបញ្ចូលគ្នាជាឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា GA និង GA ហើយបង្ហាញថា ការបញ្ចេញមតិឌីផេរ៉ង់ស្យែលនៃឧបករណ៍ទទួល GID1 អាចកែប្រែភាពបញ្ចេញពន្លឺរបស់ឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាបានយ៉ាងសំខាន់។
រហូតមកដល់បច្ចុប្បន្ន ការចែកចាយសញ្ញា GA នៅក្នុង SAM នៅតែមិនច្បាស់លាស់។ ដូច្នេះ យើងបានប្រើរុក្ខជាតិដែលបញ្ចេញ qmRGA និងអ្នករាយការណ៍កោសិកាដើម pCLV3::mCherry-NLS35 ដើម្បីគណនាផែនទីបរិមាណដែលមានគុណភាពបង្ហាញខ្ពស់នៃសកម្មភាពសញ្ញា GA ដោយផ្តោតលើស្រទាប់ L1 (អេពីដេមីស; រូបភាពទី 4a, ខ សូមមើលវិធីសាស្រ្ត និងវិធីសាស្រ្តបន្ថែម) ដោយសារ L1 ដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់ក្នុងការគ្រប់គ្រងការលូតលាស់ SAM36។ នៅទីនេះ ការបញ្ចេញមតិ pCLV3::mCherry-NLS បានផ្តល់ចំណុចយោងធរណីមាត្រថេរសម្រាប់វិភាគការចែកចាយលំហ និងពេលវេលានៃសកម្មភាពសញ្ញា GA37។ ទោះបីជា GA ត្រូវបានចាត់ទុកថាសំខាន់សម្រាប់ការអភិវឌ្ឍសរីរាង្គចំហៀង4 ក៏ដោយ យើងបានសង្កេតឃើញថាសញ្ញា GA មានកម្រិតទាបនៅក្នុងដំណាក់កាលផ្កា (P) ដោយចាប់ផ្តើមពីដំណាក់កាល P3 (រូបភាពទី 4a, ខ) ខណៈពេលដែលដំណាក់កាល P1 និង P2 វ័យក្មេងមានសកម្មភាពមធ្យមស្រដៀងគ្នាទៅនឹងសកម្មភាពនៅក្នុងតំបន់កណ្តាល (រូបភាពទី 4a, ខ)។ សកម្មភាពសញ្ញា GA ខ្ពស់ជាងនេះត្រូវបានរកឃើញនៅព្រំដែនបឋមសរីរាង្គ ដោយចាប់ផ្តើមពី P1/P2 (នៅសងខាងនៃព្រំដែន) និងឡើងដល់កំពូលនៅ P4 ក៏ដូចជានៅក្នុងកោសិកាទាំងអស់នៃតំបន់គ្រឿងកុំផ្លិចដែលមានទីតាំងនៅចន្លោះបឋម (រូបភាពទី 4a, b និងរូបភាពបន្ថែម 8a, b)។ សកម្មភាពសញ្ញា GA ខ្ពស់ជាងនេះត្រូវបានគេសង្កេតឃើញមិនត្រឹមតែនៅក្នុងស្រទាប់អេពីឌែមប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែថែមទាំងនៅក្នុងស្រទាប់ L2 និងស្រទាប់ L3 ខាងលើផងដែរ (រូបភាពបន្ថែម 8b)។ លំនាំនៃសញ្ញា GA ដែលត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុង SAM ដោយប្រើ qmRGA ក៏នៅតែមិនផ្លាស់ប្តូរតាមពេលវេលាដែរ (រូបភាពបន្ថែម 8c-f, k)។ ទោះបីជារចនាសម្ព័ន្ធ qd17mRGA ត្រូវបានបន្ទាបកម្រិតជាប្រព័ន្ធនៅក្នុង SAM នៃរុក្ខជាតិ T3 ពីខ្សែឯករាជ្យចំនួនប្រាំដែលយើងបានកំណត់លក្ខណៈលម្អិតក៏ដោយ យើងអាចវិភាគលំនាំហ្វ្លុយអូរីសង់ដែលទទួលបានជាមួយនឹងរចនាសម្ព័ន្ធ pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (រូបភាពបន្ថែម 8g-j, l)។ នៅក្នុងខ្សែត្រួតពិនិត្យនេះ មានតែការផ្លាស់ប្តូរតិចតួចប៉ុណ្ណោះនៅក្នុងសមាមាត្រពន្លឺចែងចាំងត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុង SAM ប៉ុន្តែនៅក្នុងមជ្ឈមណ្ឌល SAM យើងបានសង្កេតឃើញការថយចុះយ៉ាងច្បាស់ និងមិននឹកស្មានដល់នៅក្នុង VENUS ដែលទាក់ទងនឹង TagBFP។ នេះបញ្ជាក់ថាគំរូសញ្ញាដែលសង្កេតឃើញដោយ qmRGA ឆ្លុះបញ្ចាំងពីការធ្លាក់ចុះដែលពឹងផ្អែកលើ GA នៃ mRGA-VENUS ប៉ុន្តែក៏បង្ហាញផងដែរថា qmRGA អាចប៉ាន់ស្មានលើសសកម្មភាពសញ្ញា GA នៅក្នុងមជ្ឈមណ្ឌល meristem។ សរុបមក លទ្ធផលរបស់យើងបង្ហាញពីគំរូសញ្ញា GA ដែលឆ្លុះបញ្ចាំងជាចម្បងពីការចែកចាយនៃ primordia ។ ការចែកចាយនៃតំបន់ inter-primordial (IPR) នេះគឺដោយសារតែការបង្កើតបន្តិចម្តងៗនៃសកម្មភាពសញ្ញា GA ខ្ពស់រវាង primordium កំពុងអភិវឌ្ឍ និងតំបន់កណ្តាល ខណៈពេលដែលក្នុងពេលជាមួយគ្នានេះសកម្មភាពសញ្ញា GA នៅក្នុង primordium ថយចុះ (រូបភាពទី 4c, d)។
ការចែកចាយនៃអង់តែន GID1b និង GID1c (សូមមើលខាងលើ) បង្ហាញថា ការបញ្ចេញមតិឌីផេរ៉ង់ស្យែលនៃអង់តែន GA ជួយបង្កើតគំរូនៃសកម្មភាពសញ្ញា GA នៅក្នុង SAM។ យើងឆ្ងល់ថាតើការប្រមូលផ្តុំឌីផេរ៉ង់ស្យែលនៃ GA អាចពាក់ព័ន្ធឬអត់។ ដើម្បីស៊ើបអង្កេតលទ្ធភាពនេះ យើងបានប្រើឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា GA FRET របស់ nlsGPS121។ ប្រេកង់ធ្វើឱ្យសកម្មកើនឡើងត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុង SAM នៃ nlsGPS1 ដែលបានព្យាបាលដោយ 10 μM GA4+7 រយៈពេល 100 នាទី (រូបភាពបន្ថែម 9a–e) ដែលបង្ហាញថា nlsGPS1 ឆ្លើយតបទៅនឹងការផ្លាស់ប្តូរកំហាប់ GA នៅក្នុង SAM ដូចដែលវាធ្វើនៅក្នុងឫស21។ ការចែកចាយលំហនៃភាពញឹកញាប់ធ្វើឱ្យសកម្ម nlsGPS1 បានបង្ហាញពីកម្រិត GA ទាបនៅក្នុងស្រទាប់ខាងក្រៅនៃ SAM ប៉ុន្តែបានបង្ហាញថាពួកវាត្រូវបានលើកឡើងនៅកណ្តាល និងនៅព្រំដែននៃ SAM (រូបភាពទី 4e និងរូបភាពបន្ថែម 9a,c)។ នេះបង្ហាញថា GA ក៏ត្រូវបានចែកចាយនៅក្នុង SAM ជាមួយនឹងគំរូលំហដែលអាចប្រៀបធៀបទៅនឹងអ្វីដែលបានបង្ហាញដោយ qmRGA។ ជាវិធីសាស្រ្តបំពេញបន្ថែម យើងក៏បានព្យាបាល SAM ជាមួយ GA fluorescent (GA3-, GA4-, GA7-Fl) ឬ Fl តែម្នាក់ឯងជាការគ្រប់គ្រងអវិជ្ជមាន។ សញ្ញា Fl ត្រូវបានចែកចាយពាសពេញ SAM រួមទាំងតំបន់កណ្តាល និង primordium ទោះបីជាមានអាំងតង់ស៊ីតេទាបជាងក៏ដោយ (រូបភាពទី 4j និងរូបភាពបន្ថែម 10d)។ ផ្ទុយទៅវិញ GA-Fl ទាំងបីបានប្រមូលផ្តុំជាពិសេសនៅក្នុងព្រំដែន primordium និងក្នុងកម្រិតខុសៗគ្នានៅក្នុង IPR ដែលនៅសល់ ដោយ GA7-Fl ប្រមូលផ្តុំនៅក្នុងដែនធំបំផុតនៅក្នុង IPR (រូបភាពទី 4k និងរូបភាពបន្ថែម 10a,b)។ ការវាស់បរិមាណអាំងតង់ស៊ីតេ fluorescence បានបង្ហាញថាសមាមាត្រអាំងតង់ស៊ីតេ IPR ទៅនឹងមិនមែន IPR គឺខ្ពស់ជាងនៅក្នុង SAM ដែលបានព្យាបាលដោយ GA-Fl បើប្រៀបធៀបទៅនឹង SAM ដែលបានព្យាបាលដោយ Fl (រូបភាពទី 4l និងរូបភាពបន្ថែម 10c)។ លទ្ធផលទាំងនេះរួមគ្នាបង្ហាញថា GA មានវត្តមាននៅកំហាប់ខ្ពស់ជាងនៅក្នុងកោសិកា IPR ដែលមានទីតាំងនៅជិតព្រំដែនសរីរាង្គបំផុត។ នេះបង្ហាញថាគំរូនៃសកម្មភាពសញ្ញា SAM GA កើតឡើងពីការបញ្ចេញមតិខុសគ្នានៃអ្នកទទួល GA និងការប្រមូលផ្តុំខុសគ្នានៃ GA នៅក្នុងកោសិកា IPR នៅជិតព្រំដែនសរីរាង្គ។ ដូច្នេះ ការវិភាគរបស់យើងបានបង្ហាញពីគំរូលំហ និងពេលវេលាដែលមិននឹកស្មានដល់នៃការផ្តល់សញ្ញា GA ជាមួយនឹងសកម្មភាពទាបជាងនៅកណ្តាល និងបឋមនៃ SAM និងសកម្មភាពខ្ពស់ជាងនៅក្នុង IPR នៅក្នុងតំបន់គ្រឿងកុំព្យូទ័រ។
ដើម្បីយល់ពីតួនាទីនៃសកម្មភាពសញ្ញា GA ឌីផេរ៉ង់ស្យែលនៅក្នុង SAM យើងបានវិភាគទំនាក់ទំនងរវាងសកម្មភាពសញ្ញា GA ការពង្រីកកោសិកា និងការបែងចែកកោសិកាដោយប្រើការថតរូបភាពពេលវេលាជាក់ស្តែងនៃ SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS។ ដោយសារតួនាទីរបស់ GA ក្នុងបទប្បញ្ញត្តិកំណើន ទំនាក់ទំនងវិជ្ជមានជាមួយនឹងប៉ារ៉ាម៉ែត្រពង្រីកកោសិកាត្រូវបានគេរំពឹងទុក។ ដូច្នេះ ដំបូងយើងបានប្រៀបធៀបផែនទីសកម្មភាពសញ្ញា GA ជាមួយនឹងផែនទីនៃអត្រាកំណើនផ្ទៃកោសិកា (ជាតំណាងសម្រាប់កម្លាំងនៃការពង្រីកកោសិកាសម្រាប់កោសិកាដែលបានផ្តល់ឱ្យ និងសម្រាប់កោសិកាកូនស្រីនៅពេលបែងចែក) និងជាមួយផែនទីនៃ anisotropy កំណើន ដែលវាស់ស្ទង់ទិសដៅនៃការពង្រីកកោសិកា (ក៏ត្រូវបានប្រើនៅទីនេះសម្រាប់កោសិកាដែលបានផ្តល់ឱ្យ និងសម្រាប់កោសិកាកូនស្រីនៅពេលបែងចែក; រូបភាពទី 5a,b សូមមើលវិធីសាស្រ្ត និងវិធីសាស្រ្តបន្ថែម)។ ផែនទីរបស់យើងនៃអត្រាកំណើនផ្ទៃកោសិកា SAM គឺស្របនឹងការសង្កេតពីមុន 38,39 ជាមួយនឹងអត្រាកំណើនតិចតួចបំផុតនៅព្រំដែន និងអត្រាកំណើនអតិបរមានៅក្នុងផ្កាដែលកំពុងលូតលាស់ (រូបភាពទី 5a)។ ការវិភាគសមាសធាតុចម្បង (PCA) បានបង្ហាញថាសកម្មភាពសញ្ញា GA មានទំនាក់ទំនងអវិជ្ជមានជាមួយនឹងអាំងតង់ស៊ីតេនៃការលូតលាស់ផ្ទៃកោសិកា (រូបភាពទី 5c)។ យើងក៏បានបង្ហាញផងដែរថា អ័ក្សសំខាន់ៗនៃការប្រែប្រួល រួមទាំងការបញ្ចូលសញ្ញា GA និងអាំងតង់ស៊ីតេនៃការលូតលាស់ គឺស្របទៅនឹងទិសដៅដែលកំណត់ដោយការបញ្ចេញមតិ CLV3 ខ្ពស់ ដែលបញ្ជាក់ពីការដកចេញកោសិកាពីមជ្ឈមណ្ឌល SAM នៅក្នុងការវិភាគដែលនៅសល់។ ការវិភាគសហសម្ព័ន្ធ Spearman បានបញ្ជាក់ពីលទ្ធផល PCA (រូបភាពទី 5d) ដែលបង្ហាញថាសញ្ញា GA ខ្ពស់នៅក្នុង IPR មិនបានបណ្តាលឱ្យមានការពង្រីកកោសិកាខ្ពស់នោះទេ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការវិភាគសហសម្ព័ន្ធបានបង្ហាញពីសហសម្ព័ន្ធវិជ្ជមានបន្តិចបន្តួចរវាងសកម្មភាពសញ្ញា GA និង anisotropy នៃការលូតលាស់ (រូបភាពទី 5c, d) ដែលបង្ហាញថាសញ្ញា GA ខ្ពស់នៅក្នុង IPR មានឥទ្ធិពលលើទិសដៅនៃការលូតលាស់កោសិកា និងប្រហែលជាទីតាំងនៃប្លង់បែងចែកកោសិកា។
ក, ខ ផែនទីកំដៅនៃការលូតលាស់ផ្ទៃមធ្យម (ក) និង anisotropy ការលូតលាស់ (ខ) នៅក្នុង SAM មានជាមធ្យមលើរុក្ខជាតិឯករាជ្យចំនួនប្រាំពីរ (ប្រើជាប្រូកស៊ីសម្រាប់កម្លាំង និងទិសដៅនៃការពង្រីកកោសិការៀងៗខ្លួន)។ គ ការវិភាគ PCA រួមមានអថេរដូចខាងក្រោម៖ សញ្ញា GA អាំងតង់ស៊ីតេការលូតលាស់ផ្ទៃ anisotropy ការលូតលាស់ផ្ទៃ និងការបញ្ចេញមតិ CLV3។ សមាសធាតុ PCA 1 មានទំនាក់ទំនងអវិជ្ជមានជាចម្បងជាមួយនឹងអាំងតង់ស៊ីតេការលូតលាស់ផ្ទៃ និងមានទំនាក់ទំនងវិជ្ជមានជាមួយសញ្ញា GA។ សមាសធាតុ PCA 2 មានទំនាក់ទំនងវិជ្ជមានជាចម្បងជាមួយនឹង anisotropy ការលូតលាស់ផ្ទៃ និងមានទំនាក់ទំនងអវិជ្ជមានជាមួយការបញ្ចេញមតិ CLV3។ ភាគរយតំណាងឱ្យបំរែបំរួលដែលពន្យល់ដោយសមាសធាតុនីមួយៗ។ ឃ ការវិភាគសហសម្ព័ន្ធ Spearman រវាងសញ្ញា GA អាំងតង់ស៊ីតេការលូតលាស់ផ្ទៃ និង anisotropy ការលូតលាស់ផ្ទៃនៅមាត្រដ្ឋានជាលិកាមិនរាប់បញ្ចូល CZ។ លេខនៅខាងស្តាំគឺជាតម្លៃ Spearman rho រវាងអថេរពីរ។ សញ្ញាផ្កាយបង្ហាញពីករណីដែលសហសម្ព័ន្ធ/សហសម្ព័ន្ធអវិជ្ជមានមានសារៈសំខាន់ខ្ពស់។ ង ការមើលឃើញ 3D នៃកោសិកា Col-0 SAM L1 ដោយមីក្រូទស្សន៍ confocal។ ជញ្ជាំងកោសិកាថ្មីដែលបង្កើតឡើងនៅក្នុង SAM (ប៉ុន្តែមិនមែន primordium ទេ) ​​នៅ 10 ម៉ោងត្រូវបានលាបពណ៌តាមតម្លៃមុំរបស់វា។ របារពណ៌ត្រូវបានបង្ហាញនៅជ្រុងខាងស្តាំខាងក្រោម។ រូបភាពបញ្ចូលបង្ហាញរូបភាព 3D ដែលត្រូវគ្នានៅ 0 ម៉ោង។ ការពិសោធន៍ត្រូវបានធ្វើម្តងទៀតពីរដងជាមួយនឹងលទ្ធផលស្រដៀងគ្នា។ f គំនូសប្រអប់បង្ហាញអត្រាបែងចែកកោសិកានៅក្នុង IPR និង non-IPR Col-0 SAM (n = 10 រុក្ខជាតិឯករាជ្យ)។ ខ្សែកណ្តាលបង្ហាញមេឌីយ៉ាន ហើយព្រំដែនប្រអប់បង្ហាញពីភាគរយទី 25 និងទី 75។ ពុកមាត់បង្ហាញពីតម្លៃអប្បបរមា និងអតិបរមាដែលកំណត់ជាមួយកម្មវិធី R។ តម្លៃ P ត្រូវបានទទួលជាមួយនឹងការធ្វើតេស្ត t ពីរកន្ទុយរបស់ Welch។ g, h ដ្យាក្រាមគ្រោងការណ៍បង្ហាញ (g) របៀបវាស់មុំនៃជញ្ជាំងកោសិកាថ្មី (ពណ៌ស្វាយ) ទាក់ទងទៅនឹងទិសដៅរ៉ាឌីកាល់ពីកណ្តាលនៃ SAM (បន្ទាត់ចំនុចពណ៌ស) (មានតែតម្លៃមុំស្រួច ពោលគឺ 0–90° ត្រូវបានពិចារណា) និង (h) ទិសដៅរង្វង់/ចំហៀង និងរ៉ាឌីកាល់នៅក្នុងមេរីស្ទីម។ i អ៊ីស្តូក្រាមប្រេកង់នៃទិសដៅប្លង់បែងចែកកោសិកាឆ្លងកាត់ SAM (ពណ៌ខៀវចាស់) IPR (ពណ៌ខៀវមធ្យម) និង non-IPR (ពណ៌ខៀវខ្ចី) រៀងៗខ្លួន។ តម្លៃ P ត្រូវបានទទួលដោយការធ្វើតេស្ត Kolmogorov-Smirnov កន្ទុយពីរ។ ការពិសោធន៍ត្រូវបានធ្វើម្តងទៀតពីរដងជាមួយនឹងលទ្ធផលស្រដៀងគ្នា។ j អ៊ីស្តូក្រាមប្រេកង់នៃទិសដៅប្លង់បែងចែកកោសិកានៃ IPR ជុំវិញ P3 (ពណ៌បៃតងខ្ចី) P4 (ពណ៌បៃតងមធ្យម) និង P5 (ពណ៌បៃតងចាស់) រៀងៗខ្លួន។ តម្លៃ P ត្រូវបានទទួលដោយការធ្វើតេស្ត Kolmogorov-Smirnov កន្ទុយពីរ។ ការពិសោធន៍ត្រូវបានធ្វើម្តងទៀតពីរដងជាមួយនឹងលទ្ធផលស្រដៀងគ្នា។
ដូច្នេះ យើងបានស៊ើបអង្កេតទំនាក់ទំនងរវាងសកម្មភាពបញ្ជូនសញ្ញា GA និងការបែងចែកកោសិកាដោយកំណត់អត្តសញ្ញាណជញ្ជាំងកោសិកាដែលទើបបង្កើតថ្មីក្នុងអំឡុងពេលវិភាគ (រូបភាពទី 5e)។ វិធីសាស្រ្តនេះអនុញ្ញាតឱ្យយើងវាស់ប្រេកង់ និងទិសដៅនៃការបែងចែកកោសិកា។ គួរឱ្យភ្ញាក់ផ្អើល យើងបានរកឃើញថា ភាពញឹកញាប់នៃការបែងចែកកោសិកានៅក្នុង IPR និង SAM ដែលនៅសល់ (មិនមែន IPR រូបភាពទី 5f) គឺស្រដៀងគ្នា ដែលបង្ហាញថា ភាពខុសគ្នានៃសញ្ញា GA រវាងកោសិកា IPR និងកោសិកាមិនមែន IPR មិនប៉ះពាល់គួរឱ្យកត់សម្គាល់ដល់ការបែងចែកកោសិកានោះទេ។ នេះ និងទំនាក់ទំនងវិជ្ជមានរវាងសញ្ញា GA និង anisotropy នៃការលូតលាស់ បានជំរុញឱ្យយើងពិចារណាថាតើសកម្មភាពបញ្ជូនសញ្ញា GA អាចមានឥទ្ធិពលលើទិសដៅនៃប្លង់បែងចែកកោសិកាដែរឬទេ។ យើងបានវាស់ទិសដៅនៃជញ្ជាំងកោសិកាថ្មីជាមុំស្រួចទាក់ទងទៅនឹងអ័ក្សរ៉ាឌីកាល់ដែលភ្ជាប់កណ្តាលមេរីស្តេម និងកណ្តាលនៃជញ្ជាំងកោសិកាថ្មី (រូបភាពទី 5e-i) ហើយបានសង្កេតឃើញទំនោរច្បាស់លាស់សម្រាប់កោសិកាក្នុងការចែកខ្លួននៅមុំជិត 90° ទាក់ទងទៅនឹងអ័ក្សរ៉ាឌីកាល់ ជាមួយនឹងប្រេកង់ខ្ពស់បំផុតដែលត្រូវបានសង្កេតឃើញនៅ 70–80° (23.28%) និង 80–90° (22.62%) (រូបភាពទី 5e,i) ដែលត្រូវគ្នាទៅនឹងការបែងចែកកោសិកាក្នុងទិសដៅរង្វង់/ឆ្លងកាត់ (រូបភាពទី 5h)។ ដើម្បីពិនិត្យមើលការរួមចំណែកនៃសញ្ញា GA ចំពោះឥរិយាបថបែងចែកកោសិកានេះ យើងបានវិភាគប៉ារ៉ាម៉ែត្របែងចែកកោសិកានៅក្នុង IPR និងមិនមែន IPR ដោយឡែកពីគ្នា (រូបភាពទី 5i)។ យើងបានសង្កេតឃើញថា ការចែកចាយមុំបែងចែកនៅក្នុងកោសិកា IPR ខុសពីកោសិកាដែលមិនមែនជា IPR ឬនៅក្នុងកោសិកានៅក្នុង SAM ទាំងមូល ដោយកោសិកា IPR បង្ហាញសមាមាត្រខ្ពស់ជាងនៃការបែងចែកកោសិកាចំហៀង/រង្វង់ ពោលគឺ 70–80° និង 80–90° (33.86% និង 30.71% រៀងគ្នា សមាមាត្រដែលត្រូវគ្នា) (រូបភាពទី 5i)។ ដូច្នេះ ការសង្កេតរបស់យើងបានបង្ហាញពីទំនាក់ទំនងរវាងសញ្ញា GA ខ្ពស់ និងទិសដៅប្លង់បែងចែកកោសិកាជិតទិសដៅរង្វង់ ស្រដៀងគ្នាទៅនឹងទំនាក់ទំនងរវាងសកម្មភាពសញ្ញា GA និង anisotropy ការលូតលាស់ (រូបភាពទី 5c, d)។ ដើម្បីបង្កើតបន្ថែមទៀតនូវការអភិរក្សលំហនៃទំនាក់ទំនងនេះ យើងបានវាស់ទិសដៅប្លង់បែងចែកនៅក្នុងកោសិកា IPR ជុំវិញ primordium ដោយចាប់ផ្តើមពី P3 ដោយសារសកម្មភាពសញ្ញា GA ខ្ពស់បំផុតត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងតំបន់នេះដោយចាប់ផ្តើមពី P4 (រូបភាពទី 4)។ មុំបែងចែកនៃ IPR ជុំវិញ P3 និង P4 មិនបានបង្ហាញភាពខុសគ្នាគួរឱ្យកត់សម្គាល់ខាងស្ថិតិទេ ទោះបីជាភាពញឹកញាប់កើនឡើងនៃការបែងចែកកោសិកាចំហៀងត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុង IPR ជុំវិញ P4 (រូបភាពទី 5j) ក៏ដោយ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ នៅក្នុងកោសិកា IPR ជុំវិញ P5 ភាពខុសគ្នានៃទិសដៅនៃប្លង់បែងចែកកោសិកាបានក្លាយជាមានសារៈសំខាន់ខាងស្ថិតិ ជាមួយនឹងការកើនឡើងយ៉ាងខ្លាំងនៃភាពញឹកញាប់នៃការបែងចែកកោសិកាឆ្លងកាត់ (រូបភាពទី 5j)។ លទ្ធផលទាំងនេះរួមគ្នាបង្ហាញថា សញ្ញា GA អាចគ្រប់គ្រងទិសដៅនៃការបែងចែកកោសិកានៅក្នុង SAM ដែលស្របនឹងរបាយការណ៍មុនៗ40,41 ដែលសញ្ញា GA ខ្ពស់អាចបង្កឱ្យមានទិសដៅចំហៀងនៃការបែងចែកកោសិកានៅក្នុង IPR។
វាត្រូវបានគេព្យាករណ៍ថាកោសិកានៅក្នុង IPR នឹងមិនត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុង primordia ទេ ប៉ុន្តែផ្ទុយទៅវិញទៅក្នុង internodes2,42,43។ ទិសដៅឆ្លងកាត់នៃការបែងចែកកោសិកានៅក្នុង IPR អាចបណ្តាលឱ្យមានការរៀបចំធម្មតានៃជួរបណ្តោយស្របគ្នានៃកោសិកា epidermal នៅក្នុង internodes។ ការសង្កេតរបស់យើងដែលបានពិពណ៌នាខាងលើបង្ហាញថា ការផ្តល់សញ្ញា GA ទំនងជាដើរតួនាទីក្នុងដំណើរការនេះដោយការគ្រប់គ្រងទិសដៅនៃការបែងចែកកោសិកា។
ការបាត់បង់មុខងាររបស់ហ្សែន DELLA ជាច្រើនបណ្តាលឱ្យមានការឆ្លើយតប GA ជាប់លាប់ ហើយការផ្លាស់ប្តូរហ្សែន della អាចត្រូវបានប្រើដើម្បីសាកល្បងសម្មតិកម្មនេះ44។ ដំបូងយើងបានវិភាគគំរូនៃការបញ្ចេញមតិនៃហ្សែន DELLA ចំនួនប្រាំនៅក្នុង SAM។ ការបញ្ចូលគ្នានៃការចម្លងនៃខ្សែ GUS45 បានបង្ហាញថា GAI, RGA, RGL1 និង RGL2 (ក្នុងកម្រិតតិចជាងច្រើន) ត្រូវបានបង្ហាញនៅក្នុង SAM (រូបភាពបន្ថែម 11a-d)។ ការបង្កាត់ពូជនៅនឹងកន្លែងបានបង្ហាញបន្ថែមទៀតថា mRNA GAI កកកុញជាពិសេសនៅក្នុងផ្កា primordia និងផ្កាដែលកំពុងលូតលាស់ (រូបភាពបន្ថែម 11e)។ mRNA RGL1 និង RGL3 ត្រូវបានរកឃើញនៅទូទាំង canopy SAM និងនៅក្នុងផ្កាចាស់ៗ ខណៈពេលដែល mRNA RGL2 មានច្រើននៅក្នុងតំបន់ព្រំដែន (រូបភាពបន្ថែម 11f-h)។ ការថតរូបភាព Confocal នៃ pRGL3::RGL3-GFP SAM បានបញ្ជាក់ពីការបញ្ចេញមតិដែលសង្កេតឃើញដោយការបង្កាត់ពូជនៅនឹងកន្លែង ហើយបានបង្ហាញថាប្រូតេអ៊ីន RGL3 កកកុញនៅក្នុងផ្នែកកណ្តាលនៃ SAM (រូបភាពបន្ថែម 11i)។ ដោយប្រើខ្សែ pRGA::GFP-RGA យើងក៏បានរកឃើញផងដែរថាប្រូតេអ៊ីន RGA កកកុញនៅក្នុង SAM ប៉ុន្តែបរិមាណរបស់វាថយចុះនៅព្រំដែនចាប់ផ្តើមពី P4 (រូបភាពបន្ថែម 11j)។ ជាពិសេស គំរូនៃការបញ្ចេញមតិរបស់ RGL3 និង RGA គឺស្របនឹងសកម្មភាពសញ្ញា GA ខ្ពស់នៅក្នុង IPR ដូចដែលបានរកឃើញដោយ qmRGA (រូបភាពទី 4)។ លើសពីនេះ ទិន្នន័យទាំងនេះបង្ហាញថា DELLA ទាំងអស់ត្រូវបានបង្ហាញនៅក្នុង SAM ហើយការបញ្ចេញមតិរបស់ពួកគេរួមគ្នាគ្របដណ្តប់លើ SAM ទាំងមូល។
បន្ទាប់មក យើងបានវិភាគប៉ារ៉ាម៉ែត្រនៃការបែងចែកកោសិកានៅក្នុង SAM ប្រភេទធម្មជាតិ (Ler, ការគ្រប់គ្រង) និង gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (សកល) mutants (រូបភាពទី 6a, ខ)។ គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ យើងបានសង្កេតឃើញការផ្លាស់ប្តូរគួរឱ្យកត់សម្គាល់ខាងស្ថិតិនៅក្នុងការចែកចាយប្រេកង់មុំនៃការបែងចែកកោសិកានៅក្នុង SAM ប្រភេទ della global mutant បើប្រៀបធៀបទៅនឹងប្រភេទធម្មជាតិ (រូបភាពទី 6c)។ ការផ្លាស់ប្តូរនេះនៅក្នុង della global mutant គឺដោយសារតែការកើនឡើងនៃប្រេកង់នៃមុំ 80–90° (34.71% ទល់នឹង 24.55%) និងក្នុងកម្រិតតិចជាងនេះ មុំ 70–80° (23.78% ទល់នឹង 20.18%) ពោលគឺត្រូវគ្នាទៅនឹងការបែងចែកកោសិកាឆ្លងកាត់ (រូបភាពទី 6c)។ ភាពញឹកញាប់នៃការបែងចែកមិនឆ្លងកាត់ (0–60°) ក៏ទាបជាងនៅក្នុង della global mutant (រូបភាពទី 6c)។ ភាពញឹកញាប់នៃការបែងចែកកោសិកាឆ្លងកាត់បានកើនឡើងគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៅក្នុង SAM នៃការផ្លាស់ប្តូរហ្សែន della global (រូបភាពទី 6b)។ ភាពញឹកញាប់នៃការបែងចែកកោសិកាឆ្លងកាត់នៅក្នុង IPR ក៏ខ្ពស់ជាងនៅក្នុងការផ្លាស់ប្តូរហ្សែន della global បើប្រៀបធៀបទៅនឹងប្រភេទធម្មតា (រូបភាពទី 6d)។ នៅខាងក្រៅតំបន់ IPR ប្រភេទធម្មតាមានការចែកចាយមុំបែងចែកកោសិកាឯកសណ្ឋានជាង ខណៈពេលដែលការផ្លាស់ប្តូរហ្សែន della global ចូលចិត្តការបែងចែកតង់សង់ដូចជា IPR (រូបភាពទី 6e)។ យើងក៏បានវាស់វែងទិសដៅនៃការបែងចែកកោសិកានៅក្នុង SAM នៃការផ្លាស់ប្តូរហ្សែន ga2 oxidase (ga2ox) ប្រាំបួន (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, និង ga2ox6-2) ដែលជាផ្ទៃខាងក្រោយការផ្លាស់ប្តូរហ្សែនអសកម្ម GA ដែល GA កកកុញ។ ស្រប​នឹង​ការ​កើនឡើង​នៃ​កម្រិត GA SAM នៃ​ផ្កា​ដែល​មាន​ការ​ផ្លាស់ប្តូរ​ហ្សែន ga2ox ចំនួន​ប្រាំ​គឺ​ធំ​ជាង​ផ្កា Col-0 (រូបភាព​បន្ថែម 12a, b) ហើយ​បើ​ធៀប​នឹង Col-0 ផ្កា SAM ga2ox ចំនួន​ប្រាំ​បាន​បង្ហាញ​ពី​ការ​ចែកចាយ​មុំ​បែងចែក​កោសិកា​ខុស​គ្នា​យ៉ាង​ច្បាស់ ដោយ​ប្រេកង់​មុំ​កើនឡើង​ពី 50° ដល់ 90° ពោល​គឺ​ពេញចិត្ត​នឹង​ការ​បែងចែក​តង់សង់ (រូបភាព​បន្ថែម 12a–c)។ ដូច្នេះ យើង​បង្ហាញ​ថា​ការ​ធ្វើ​ឲ្យ​សកម្ម​ជា​ប្រចាំ​នៃ​សញ្ញា GA និង​ការ​ប្រមូលផ្តុំ GA បង្ក​ឲ្យ​មាន​ការ​បែងចែក​កោសិកា​ចំហៀង​នៅ​ក្នុង IPR និង​ផ្នែក​ផ្សេង​ទៀត​នៃ SAM។
a, b ការមើលឃើញ 3D នៃស្រទាប់ L1 នៃ Ler ដែលប្រឡាក់ដោយ PI (a) និង global della mutant (b) SAM ដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍ confocal ។ ជញ្ជាំងកោសិកាថ្មីដែលបង្កើតឡើងនៅក្នុង SAM (ប៉ុន្តែមិនមែន primordium ទេ) ​​ក្នុងរយៈពេល 10 ម៉ោងត្រូវបានបង្ហាញ និងដាក់ពណ៌តាមតម្លៃមុំរបស់វា។ រូបភាពបញ្ចូលបង្ហាញ SAM នៅ 0 ម៉ោង។ របារពណ៌ត្រូវបានបង្ហាញនៅជ្រុងខាងស្តាំខាងក្រោម។ ព្រួញក្នុង (b) ចង្អុលទៅឧទាហរណ៍នៃឯកសារកោសិកាដែលតម្រឹមគ្នានៅក្នុង global della mutant ។ ការពិសោធន៍ត្រូវបានធ្វើម្តងទៀតពីរដងជាមួយនឹងលទ្ធផលស្រដៀងគ្នា។ ce ការប្រៀបធៀបនៃការចែកចាយប្រេកង់នៃទិសដៅប្លង់បែងចែកកោសិកានៅក្នុង SAM ទាំងមូល (d), IPR (e) និងមិនមែន IPR (f) រវាង Ler និង global della ។ តម្លៃ P ត្រូវបានទទួលដោយប្រើការធ្វើតេស្ត Kolmogorov-Smirnov ពីរកន្ទុយ។ f, g ការមើលឃើញ 3D នៃរូបភាព confocal នៃ SAM ដែលប្រឡាក់ដោយ PI នៃរុក្ខជាតិប្តូរហ្សែន Col-0 (i) និង pCUC2::gai-1-VENUS (j)។ បន្ទះ (ក, ខ) បង្ហាញជញ្ជាំងកោសិកាថ្មី (ប៉ុន្តែមិនមែន primordia) ដែលបានបង្កើតឡើងនៅក្នុង SAM ក្នុងរយៈពេល 10 ម៉ោង។ ការពិសោធន៍ត្រូវបានធ្វើម្តងទៀតពីរដងជាមួយនឹងលទ្ធផលស្រដៀងគ្នា។ h–j ការប្រៀបធៀបនៃការចែកចាយប្រេកង់នៃទិសដៅប្លង់បែងចែកកោសិកាដែលមានទីតាំងនៅ SAM ទាំងមូល (h), IPR (i) និងមិនមែន IPR (j) រវាងរុក្ខជាតិ Col-0 និង pCUC2::gai-1-VENUS។ តម្លៃ P ត្រូវបានទទួលដោយប្រើការធ្វើតេស្ត Kolmogorov–Smirnov ពីរកន្ទុយ។
បន្ទាប់មក យើងបានសាកល្បងប្រសិទ្ធភាពនៃការរារាំងសញ្ញា GA ជាពិសេសនៅក្នុង IPR។ ចំពោះគោលបំណងនេះ យើងបានប្រើប្រូម៉ូទ័រពែងស្លឹក 2 (CUC2) ដើម្បីជំរុញការបញ្ចេញមតិនៃប្រូតេអ៊ីន gai-1 អវិជ្ជមានលេចធ្លោដែលភ្ជាប់ទៅនឹង VENUS (នៅក្នុងខ្សែ pCUC2::gai-1-VENUS)។ នៅក្នុង SAM ប្រភេទព្រៃ ប្រូម៉ូទ័រ CUC2 ជំរុញការបញ្ចេញមតិនៃ IPR ភាគច្រើននៅក្នុង SAM រួមទាំងកោសិកាព្រំដែន ចាប់ពី P4 តទៅ ហើយការបញ្ចេញមតិជាក់លាក់ស្រដៀងគ្នានេះត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុងរុក្ខជាតិ pCUC2::gai-1-VENUS (សូមមើលខាងក្រោម)។ ការចែកចាយមុំបែងចែកកោសិកាឆ្លងកាត់ SAM ឬ IPR នៃរុក្ខជាតិ pCUC2::gai-1-VENUS មិនមានភាពខុសគ្នាគួរឱ្យកត់សម្គាល់ពីមុំបែងចែកកោសិកាប្រភេទព្រៃនោះទេ ទោះបីជាមិននឹកស្មានដល់ក៏ដោយ យើងបានរកឃើញថាកោសិកាដែលគ្មាន IPR នៅក្នុងរុក្ខជាតិទាំងនេះបែងចែកនៅប្រេកង់ខ្ពស់ជាង 80–90° (រូបភាពទី 6f–j)។
វាត្រូវបានគេណែនាំថាទិសដៅនៃការបែងចែកកោសិកាអាស្រ័យលើធរណីមាត្រនៃ SAM ជាពិសេសភាពតានតឹង tensile ដែលបង្កើតឡើងដោយកោងជាលិកា46។ ដូច្នេះយើងបានសួរថាតើរូបរាងរបស់ SAM ត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុងរុក្ខជាតិ della global mutant និង pCUC2::gai-1-VENUS ដែរឬទេ។ ដូចដែលបានរាយការណ៍ពីមុន12 ទំហំនៃ SAM della global mutant គឺធំជាងទំហំរបស់ប្រភេទព្រៃ (រូបភាពបន្ថែម 13a, b, d)។ ការបង្កាត់ពូជនៅនឹងកន្លែងនៃ CLV3 និង STM RNA បានបញ្ជាក់ពីការពង្រីក meristem នៅក្នុង della mutants និងបានបង្ហាញបន្ថែមទៀតអំពីការពង្រីកចំហៀងនៃ niche កោសិកាដើម (រូបភាពបន្ថែម 13e, f, h, i)។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ កោង SAM គឺស្រដៀងគ្នានៅក្នុង genotype ទាំងពីរ (រូបភាពបន្ថែម 13k, m, n, p)។ យើងបានសង្កេតឃើញការកើនឡើងស្រដៀងគ្នានៃទំហំនៅក្នុងហ្សែន gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant ដោយគ្មានការផ្លាស់ប្តូរកោងបើប្រៀបធៀបទៅនឹងប្រភេទធម្មតា (រូបភាពបន្ថែម 13c, d, g, j, l, o, p)។ ភាពញឹកញាប់នៃការតំរង់ទិសនៃការបែងចែកកោសិកាក៏ត្រូវបានប៉ះពាល់នៅក្នុងហ្សែន della quadruple mutant ដែរ ប៉ុន្តែក្នុងកម្រិតតិចជាងនៅក្នុងហ្សែន della monolithic mutant (រូបភាពបន្ថែម 12d–f)។ ឥទ្ធិពលកម្រិតថ្នាំនេះ រួមជាមួយនឹងការខ្វះឥទ្ធិពលលើកោង បង្ហាញថាសកម្មភាព RGL3 ដែលនៅសេសសល់នៅក្នុងហ្សែន Della quadruple mutant កំណត់ការផ្លាស់ប្តូរទិសដៅនៃការបែងចែកកោសិកាដែលបណ្តាលមកពីការបាត់បង់សកម្មភាព DELLA ហើយថាការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុងការបែងចែកកោសិកាចំហៀងកើតឡើងជាការឆ្លើយតបទៅនឹងការផ្លាស់ប្តូរសកម្មភាពសញ្ញា GA ជាជាងការផ្លាស់ប្តូរធរណីមាត្រ SAM។ ដូចដែលបានពិពណ៌នាខាងលើ ប្រូម៉ូទ័រ CUC2 ជំរុញការបញ្ចេញមតិ IPR នៅក្នុង SAM ដោយចាប់ផ្តើមពី P4 (រូបភាពបន្ថែម 14a, b) ហើយផ្ទុយទៅវិញ pCUC2::gai-1-VENUS SAM មានទំហំតូចជាង ប៉ុន្តែមានរាងកោងខ្ពស់ជាង (រូបភាពបន្ថែម 14c–h)។ ការផ្លាស់ប្តូរនេះនៅក្នុងរូបរាង pCUC2::gai-1-VENUS SAM អាចបណ្តាលឱ្យមានការចែកចាយភាពតានតឹងមេកានិចខុសគ្នាបើប្រៀបធៀបទៅនឹងប្រភេទធម្មជាតិ ដែលភាពតានតឹងរង្វង់មូលខ្ពស់ចាប់ផ្តើមនៅចម្ងាយខ្លីជាងពីកណ្តាល SAM47។ ម៉្យាងវិញទៀត ការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុងរូបរាង pCUC2::gai-1-VENUS SAM អាចបណ្តាលមកពីការផ្លាស់ប្តូរលក្ខណៈសម្បត្តិមេកានិចក្នុងតំបន់ដែលបង្កឡើងដោយការបញ្ចេញមតិ transgene48។ ក្នុងករណីទាំងពីរ នេះអាចទូទាត់ដោយផ្នែកនូវផលប៉ះពាល់នៃការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុងសញ្ញា GA ដោយបង្កើនលទ្ធភាពដែលកោសិកានឹងបែងចែកនៅក្នុងទិសដៅរង្វង់មូល/ឆ្លងកាត់ ដោយពន្យល់ពីការសង្កេតរបស់យើង។
ប្រសិនបើយើងពិចារណារួមគ្នា ទិន្នន័យរបស់យើងបញ្ជាក់ថា សញ្ញា GA ខ្ពស់ដើរតួនាទីយ៉ាងសកម្មនៅក្នុងទិសដៅចំហៀងនៃប្លង់បែងចែកកោសិកានៅក្នុង IPR។ ពួកវាក៏បង្ហាញផងដែរថា ការកោងនៃមេរីស្តេមក៏មានឥទ្ធិពលលើទិសដៅនៃប្លង់បែងចែកកោសិកានៅក្នុង IPR ផងដែរ។
ទិសដៅឆ្លងកាត់នៃប្លង់បែងចែកនៅក្នុង IPR ដោយសារតែសកម្មភាពសញ្ញា GA ខ្ពស់ បង្ហាញថា GA រៀបចំជាមុននូវឯកសារកោសិការ៉ាឌីកាល់នៅក្នុងអេពីឌឺមនៅក្នុង SAM ដើម្បីកំណត់អង្គការកោសិកាដែលក្រោយមកនឹងត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុង internode អេពីឌឺម។ ជាការពិតណាស់ ឯកសារកោសិកាបែបនេះអាចមើលឃើញជាញឹកញាប់នៅក្នុងរូបភាព SAM នៃ della global mutants (រូបភាពទី 6b)។ ដូច្នេះ ដើម្បីស្វែងយល់បន្ថែមអំពីមុខងារអភិវឌ្ឍន៍នៃលំនាំលំហនៃសញ្ញា GA នៅក្នុង SAM យើងបានប្រើការថតរូបភាពតាមពេលវេលាដើម្បីវិភាគការរៀបចំលំហនៃកោសិកានៅក្នុង IPR នៅក្នុងរុក្ខជាតិប្រភេទធម្មជាតិ (Ler និង Col-0) della global mutants និង pCUC2::gai-1-VENUS transgenic plants។
យើងបានរកឃើញថា qmRGA បានបង្ហាញថាសកម្មភាពសញ្ញា GA នៅក្នុង IPR បានកើនឡើងពី P1/P2 ហើយបានឡើងដល់កំពូលនៅ P4 ហើយលំនាំនេះនៅតែមិនផ្លាស់ប្តូរតាមពេលវេលា (រូបភាពទី 4a–f និងរូបភាពបន្ថែម 8c–f, k)។ ដើម្បីវិភាគការរៀបចំលំហនៃកោសិកានៅក្នុង IPR ជាមួយនឹងការកើនឡើងនៃសញ្ញា GA យើងបានដាក់ស្លាកកោសិកា Ler IPR ខាងលើ និងទៅចំហៀងនៃ P4 យោងទៅតាមជោគវាសនានៃការអភិវឌ្ឍរបស់ពួកវាដែលបានវិភាគ 34 ម៉ោងបន្ទាប់ពីការសង្កេតលើកដំបូង ពោលគឺច្រើនជាងពីរដងនៃពេលវេលាផ្លាស្ទីត ដែលអនុញ្ញាតឱ្យយើងតាមដានកោសិកា IPR ក្នុងអំឡុងពេលនៃការអភិវឌ្ឍ primordium ពី P1/P2 ដល់ P4។ យើងបានប្រើពណ៌បីផ្សេងគ្នា៖ ពណ៌លឿងសម្រាប់កោសិកាទាំងនោះដែលត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុង primordium នៅជិត P4 ពណ៌បៃតងសម្រាប់កោសិកាដែលស្ថិតនៅក្នុង IPR និងពណ៌ស្វាយសម្រាប់កោសិកាដែលចូលរួមក្នុងដំណើរការទាំងពីរ (រូបភាពទី 7a–c)។ នៅ t0 (0 ម៉ោង) ស្រទាប់កោសិកា IPR ចំនួន 1–2 អាចមើលឃើញនៅពីមុខ P4 (រូបភាពទី 7a)។ ដូចដែលរំពឹងទុក នៅពេលដែលកោសិកាទាំងនេះបែងចែក ពួកវាបានធ្វើដូច្នេះជាចម្បងតាមរយៈប្លង់បែងចែកឆ្លងកាត់ (រូបភាពទី 7a–c)។ លទ្ធផលស្រដៀងគ្នានេះត្រូវបានទទួលដោយប្រើ Col-0 SAM (ផ្តោតលើ P3 ដែលគែមរបស់វាបត់ស្រដៀងគ្នាទៅនឹង P4 នៅក្នុង Ler) ទោះបីជានៅក្នុងហ្សែនទីបនេះ ផ្នត់ដែលបង្កើតឡើងនៅគែមផ្កាលាក់កោសិកា IPR លឿនជាងមុនក៏ដោយ (រូបភាពទី 7g–i)។ ដូច្នេះ លំនាំបែងចែកនៃកោសិកា IPR រៀបចំកោសិកាជាមុនទៅជាជួររ៉ាឌីកាល់ ដូចនៅក្នុងអន្តរណូដ។ ការរៀបចំជួររ៉ាឌីកាល់ និងទីតាំងនៃកោសិកា IPR រវាងសរីរាង្គជាប់ៗគ្នាបង្ហាញថាកោសិកាទាំងនេះគឺជាបុព្វបុរសអន្តរណូដ។
នៅទីនេះ យើងបានបង្កើតជីវឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា GA សមាមាត្រមួយ គឺ qmRGA ដែលអនុញ្ញាតឱ្យមានការគូសផែនទីបរិមាណនៃសកម្មភាពសញ្ញា GA ដែលជាលទ្ធផលនៃកំហាប់ GA និង GA receptor រួមបញ្ចូលគ្នា ខណៈពេលដែលកាត់បន្ថយការជ្រៀតជ្រែកជាមួយផ្លូវសញ្ញា endogenous ដោយហេតុនេះផ្តល់ព័ត៌មានអំពីមុខងារ GA នៅកម្រិតកោសិកា។ ចំពោះគោលបំណងនេះ យើងបានបង្កើតប្រូតេអ៊ីន DELLA ដែលបានកែប្រែ គឺ mRGA ដែលបានបាត់បង់សមត្ថភាពក្នុងការភ្ជាប់ដៃគូអន្តរកម្ម DELLA ប៉ុន្តែនៅតែងាយនឹងប្រតិកម្មទៅនឹង proteolysis ដែលបង្កឡើងដោយ GA។ qmRGA ឆ្លើយតបទៅនឹងការផ្លាស់ប្តូរទាំងខាងក្រៅ និងខាងក្នុងនៅក្នុងកម្រិត GA ហើយលក្ខណៈសម្បត្តិចាប់សញ្ញាថាមវន្តរបស់វាអនុញ្ញាតឱ្យមានការវាយតម្លៃនៃការផ្លាស់ប្តូរលំហ និងពេលវេលានៅក្នុងសកម្មភាពសញ្ញា GA ក្នុងអំឡុងពេលអភិវឌ្ឍន៍។ qmRGA ក៏ជាឧបករណ៍ដែលអាចបត់បែនបានខ្លាំងផងដែរ ព្រោះវាអាចត្រូវបានសម្របទៅនឹងជាលិកាផ្សេងៗគ្នាដោយការផ្លាស់ប្តូរ promoter ដែលប្រើសម្រាប់ការបញ្ចេញមតិរបស់វា (បើចាំបាច់) និងដោយផ្តល់នូវលក្ខណៈអភិរក្សនៃផ្លូវសញ្ញា GA និង motif PFYRE ឆ្លងកាត់ angiosperms វាទំនងជាអាចផ្ទេរទៅប្រភេទសត្វដទៃទៀតបាន22។ ស្របនឹងបញ្ហានេះ ការផ្លាស់ប្តូរសមមូលនៅក្នុងប្រូតេអ៊ីនស្រូវ SLR1 DELLA (HYY497AAA) ក៏ត្រូវបានបង្ហាញផងដែរថាទប់ស្កាត់សកម្មភាពទប់ស្កាត់ការលូតលាស់របស់ SLR1 ខណៈពេលដែលកាត់បន្ថយការរិចរិលដែលសម្របសម្រួលដោយ GA របស់វាបន្តិចបន្តួច ស្រដៀងគ្នាទៅនឹង mRGA23។ ជាពិសេស ការសិក្សាថ្មីៗនៅក្នុង Arabidopsis បានបង្ហាញថា ការផ្លាស់ប្តូរអាស៊ីតអាមីណូតែមួយនៅក្នុងដែន PFYRE (S474L) បានផ្លាស់ប្តូរសកម្មភាពចម្លងនៃ RGA ដោយមិនប៉ះពាល់ដល់សមត្ថភាពរបស់វាក្នុងអន្តរកម្មជាមួយដៃគូកត្តាចម្លង50។ ទោះបីជាការផ្លាស់ប្តូរនេះគឺជិតនឹងការជំនួសអាស៊ីតអាមីណូ 3 ដែលមាននៅក្នុង mRGA ក៏ដោយ ការសិក្សារបស់យើងបង្ហាញថា ការផ្លាស់ប្តូរទាំងពីរនេះផ្លាស់ប្តូរលក្ខណៈខុសគ្នារបស់ DELLA។ ទោះបីជាដៃគូកត្តាចម្លងភាគច្រើនភ្ជាប់ទៅនឹងដែន LHR1 និង SAW នៃ DELLA26,51 ក៏ដោយ អាស៊ីតអាមីណូដែលបានរក្សាទុកមួយចំនួននៅក្នុងដែន PFYRE អាចជួយធ្វើឱ្យអន្តរកម្មទាំងនេះមានស្ថេរភាព។
ការអភិវឌ្ឍអន្តរណូតគឺជាលក្ខណៈសំខាន់មួយនៅក្នុងស្ថាបត្យកម្មរុក្ខជាតិ និងការកែលម្អទិន្នផល។ qmRGA បានបង្ហាញពីសកម្មភាពសញ្ញា GA ខ្ពស់ជាងនៅក្នុងកោសិកាដើមអន្តរណូត IPR។ ដោយការរួមបញ្ចូលគ្នានូវរូបភាពបរិមាណ និងពន្ធុវិទ្យា យើងបានបង្ហាញថាលំនាំសញ្ញា GA ដាក់លើប្លង់បែងចែកកោសិការាងជារង្វង់/ឆ្លងកាត់នៅក្នុងអេពីដេមីស SAM ដែលបង្កើតជាការរៀបចំការបែងចែកកោសិកាដែលត្រូវការសម្រាប់ការអភិវឌ្ឍអន្តរណូត។ និយតករជាច្រើននៃទិសដៅប្លង់បែងចែកកោសិកាត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណក្នុងអំឡុងពេលអភិវឌ្ឍន៍52,53។ ការងាររបស់យើងផ្តល់នូវឧទាហរណ៍ច្បាស់លាស់អំពីរបៀបដែលសកម្មភាពសញ្ញា GA គ្រប់គ្រងប៉ារ៉ាម៉ែត្រកោសិកានេះ។ DELLA អាចមានអន្តរកម្មជាមួយស្មុគស្មាញប្រូតេអ៊ីនមុនបត់41 ដូច្នេះសញ្ញា GA អាចគ្រប់គ្រងទិសដៅប្លង់បែងចែកកោសិកាដោយជះឥទ្ធិពលដោយផ្ទាល់ទៅលើទិសដៅមីក្រូទូប៊ុល cortical40,41,54,55។ យើងបានបង្ហាញដោយមិននឹកស្មានដល់ថានៅក្នុង SAM ទំនាក់ទំនងនៃសកម្មភាពសញ្ញា GA ខ្ពស់ជាងមិនមែនជាការលាតសន្ធឹងកោសិកា ឬការបែងចែកទេ ប៉ុន្តែមានតែ anisotropy នៃការលូតលាស់ប៉ុណ្ណោះ ដែលស្របនឹងឥទ្ធិពលផ្ទាល់របស់ GA លើទិសដៅនៃការបែងចែកកោសិកានៅក្នុង IPR។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ យើងមិនអាចបដិសេធថាឥទ្ធិពលនេះក៏អាចជាប្រយោលផងដែរ ឧទាហរណ៍ដែលសម្របសម្រួលដោយការធ្វើឱ្យជញ្ជាំងកោសិកាទន់ដោយ GA56។ ការផ្លាស់ប្តូរលក្ខណៈសម្បត្តិជញ្ជាំងកោសិកាបង្កឱ្យមានភាពតានតឹងមេកានិច 57,58 ដែលក៏អាចមានឥទ្ធិពលលើការតំរង់ទិសនៃប្លង់បែងចែកកោសិកាដោយប៉ះពាល់ដល់ការតំរង់ទិសនៃមីក្រូទូប៊ុល cortical 39,46,59។ ផលប៉ះពាល់រួមបញ្ចូលគ្នានៃភាពតានតឹងមេកានិចដែលបង្កឡើងដោយ GA និងបទប្បញ្ញត្តិដោយផ្ទាល់នៃការតំរង់ទិសមីក្រូទូប៊ុលដោយ GA អាចពាក់ព័ន្ធនឹងការបង្កើតគំរូជាក់លាក់នៃការតំរង់ទិសនៃការបែងចែកកោសិកានៅក្នុង IPR ដើម្បីកំណត់ផ្នែកខាងក្នុង ហើយការសិក្សាបន្ថែមទៀតគឺត្រូវការដើម្បីសាកល្បងគំនិតនេះ។ ស្រដៀងគ្នានេះដែរ ការសិក្សាពីមុនបានបញ្ជាក់ពីសារៈសំខាន់នៃប្រូតេអ៊ីន DELLA-interacting TCP14 និង 15 ក្នុងការគ្រប់គ្រងការបង្កើតផ្នែកខាងក្នុង 60,61 ហើយកត្តាទាំងនេះអាចសម្របសម្រួលសកម្មភាពរបស់ GA រួមជាមួយ BREVIPEDICELLUS (BP) និង PENNYWISE (PNY) ដែលគ្រប់គ្រងការអភិវឌ្ឍផ្នែកខាងក្នុង និងត្រូវបានបង្ហាញថាមានឥទ្ធិពលលើសញ្ញា GA 2,62។ ដោយសារ DELLA មានអន្តរកម្មជាមួយផ្លូវសញ្ញា brassinosteroid, ethylene, jasmonic acid និង abscisic acid (ABA)63,64 ហើយអរម៉ូនទាំងនេះអាចមានឥទ្ធិពលលើការតំរង់ទិស microtubule65 ផលប៉ះពាល់នៃ GA លើការតំរង់ទិសនៃការបែងចែកកោសិកាក៏អាចត្រូវបានសម្របសម្រួលដោយអរម៉ូនដទៃទៀតផងដែរ។
ការសិក្សាស៊ីតូឡូស៊ីដំបូងបានបង្ហាញថា ទាំងតំបន់ខាងក្នុង និងខាងក្រៅនៃ Arabidopsis SAM គឺត្រូវបានទាមទារសម្រាប់ការអភិវឌ្ឍអន្តរណូត2,42។ ការពិតដែលថា GA គ្រប់គ្រងការបែងចែកកោសិកាយ៉ាងសកម្មនៅក្នុងជាលិកាខាងក្នុង12 គាំទ្រមុខងារពីររបស់ GA ក្នុងការគ្រប់គ្រងមេរីស្ទីម និងទំហំអន្តរណូតនៅក្នុង SAM។ គំរូនៃការបែងចែកកោសិកាទិសដៅក៏ត្រូវបានគ្រប់គ្រងយ៉ាងតឹងរ៉ឹងនៅក្នុងជាលិកា SAM ខាងក្នុង ហើយបទប្បញ្ញត្តិនេះគឺចាំបាច់សម្រាប់ការលូតលាស់ដើម52។ វានឹងគួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ក្នុងការពិនិត្យមើលថាតើ GA ក៏ដើរតួនាទីក្នុងការតំរង់ទិសប្លង់បែងចែកកោសិកានៅក្នុងអង្គការ SAM ខាងក្នុងដែរឬទេ ដោយហេតុនេះធ្វើសមកាលកម្មការបញ្ជាក់ និងការអភិវឌ្ឍអន្តរណូតនៅក្នុង SAM។
រុក្ខជាតិត្រូវបានដាំដុះនៅក្នុងវីត្រូនៅក្នុងដី ឬឧបករណ៍ផ្ទុក Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) ចំនួន 1 ដែលបានបន្ថែមជាមួយ sucrose 1% និង agar 1% (Sigma) ក្រោមលក្ខខណ្ឌស្តង់ដារ (ពន្លឺ 16 ម៉ោង 22 °C) លើកលែងតែការពិសោធន៍ hypocotyl និងការលូតលាស់ឫស ដែលសំណាបត្រូវបានដាំដុះនៅលើចានបញ្ឈរក្រោមពន្លឺថេរ និង 22 °C។ ចំពោះការពិសោធន៍នីត្រាត រុក្ខជាតិត្រូវបានដាំដុះនៅលើឧបករណ៍ផ្ទុក MS ដែលបានកែប្រែ (ឧបករណ៍ផ្ទុករុក្ខជាតិ bioWORLD) ដែលបានបន្ថែមជាមួយនីត្រាតគ្រប់គ្រាន់ (0 ឬ 10 mM KNO3) 0.5 mM NH4-succinate 1% sucrose និង 1% A-agar (Sigma) ក្រោមលក្ខខណ្ឌថ្ងៃយូរ។
cDNA GID1a ដែលបានបញ្ចូលទៅក្នុង pDONR221 ត្រូវបានផ្សំឡើងវិញជាមួយ pDONR P4-P1R-pUBQ10 និង pDONR P2R-P3-mCherry ទៅជា pB7m34GW ដើម្បីបង្កើត pUBQ10::GID1a-mCherry។ DNA IDD2 ដែលបានបញ្ចូលទៅក្នុង pDONR221 ត្រូវបានផ្សំឡើងវិញទៅជា pB7RWG266 ដើម្បីបង្កើត p35S:IDD2-RFP។ ដើម្បីបង្កើត pGID1b::2xmTQ2-GID1b បំណែក 3.9 kb នៅខាងលើតំបន់សរសេរកូដ GID1b និងបំណែក 4.7 kb ដែលមាន cDNA GID1b (1.3 kb) និង terminator (3.4 kb) ត្រូវបានពង្រីកជាមុនសិនដោយប្រើប្រាយម័រនៅក្នុងតារាងបន្ថែមទី 3 ហើយបន្ទាប់មកបញ្ចូលទៅក្នុង pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) និង pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) រៀងៗខ្លួន ហើយចុងក្រោយត្រូវបានផ្សំឡើងវិញជាមួយ pDONR221 2xmTQ268 ទៅក្នុងវ៉ិចទ័រគោលដៅ pGreen 012567 ដោយប្រើការក្លូន Gateway។ ដើម្បីបង្កើត pCUC2::LSSmOrange លំដាប់ប្រូម៉ូទ័រ CUC2 (3229 bp នៅខាងលើ ATG) បន្តដោយលំដាប់កូដនៃ mOrange ធំ Stokes-shifted (LSSmOrange)69 ជាមួយនឹងសញ្ញាទីតាំងនុយក្លេអ៊ែរ N7 និងឧបករណ៍បញ្ចប់ប្រតិចារិក NOS ត្រូវបានផ្គុំចូលទៅក្នុងវ៉ិចទ័រកំណត់គោលដៅ kanamycin pGreen ដោយប្រើប្រព័ន្ធបញ្ចូលគ្នាឡើងវិញ Gateway 3-fragment (Invitrogen)។ វ៉ិចទ័រគោលពីររុក្ខជាតិត្រូវបានណែនាំទៅក្នុងពូជ Agrobacterium tumefaciens GV3101 ហើយត្រូវបានណែនាំទៅក្នុងស្លឹក Nicotiana benthamiana ដោយវិធីសាស្ត្រ Agrobacterium infiltration និងចូលទៅក្នុង Arabidopsis thaliana Col-0 ដោយវិធីសាស្ត្រជ្រលក់ផ្ការៀងៗខ្លួន។ pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry និង pCLV3::mCherry-NLS qmRGA ត្រូវបានញែកចេញពីកូនចៅ F3 និង F1 នៃកូនកាត់រៀងៗខ្លួនរៀងៗខ្លួន។
ការបង្កាត់ RNA នៅនឹងកន្លែងត្រូវបានអនុវត្តលើចុងពន្លកប្រវែងប្រហែល 1 សង់ទីម៉ែត្រ72 ដែលត្រូវបានប្រមូល និងជួសជុលភ្លាមៗនៅក្នុងដំណោះស្រាយ FAA (3.7% formaldehyde, 5% acetic acid, 50% ethanol) ដែលត្រជាក់ជាមុនដល់ 4°C។ បន្ទាប់ពីការព្យាបាលដោយប្រើសុញ្ញកាសរយៈពេល 2 × 15 នាទី សារធាតុជួសជុលត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរ ហើយគំរូត្រូវបានភ្ញាស់ពេញមួយយប់។ GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, និង RGL3 cDNAs និង antisense probes ទៅកាន់ 3′-UTRs របស់ពួកវាត្រូវបានសំយោគដោយប្រើ primers ដែលបង្ហាញក្នុងតារាងបន្ថែម 3 ដូចដែលបានពិពណ៌នាដោយ Rosier et al.73។ សារធាតុស៊ើបអង្កេតដែលមានស្លាក Digoxigenin ត្រូវបានរកឃើញដោយប្រើប្រាស់អង្គបដិប្រាណ digoxigenin (ការពនលាយ 3000 ដង; Roche លេខកាតាឡុក៖ 11 093 274 910) ហើយផ្នែកនានាត្រូវបានប្រឡាក់ដោយដំណោះស្រាយ 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, ការពនលាយ 250 ដង)/nitroblue tetrazolium (NBT, ការពនលាយ 200 ដង)។