ការលូតលាស់នៃពន្លក apical meristem (SAM) គឺមានសារៈសំខាន់សម្រាប់ស្ថាបត្យកម្មដើម។ អរម៉ូនរុក្ខជាតិgibberellins(GAs) ដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់ក្នុងការសម្របសម្រួលការលូតលាស់របស់រុក្ខជាតិ ប៉ុន្តែតួនាទីរបស់ពួកគេនៅក្នុង SAM នៅតែត្រូវបានគេយល់តិចតួច។ នៅទីនេះ យើងបានបង្កើតឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាជីវមាត្រសមាមាត្រនៃសញ្ញា GA ដោយវិស្វកម្មប្រូតេអ៊ីន DELLA ដើម្បីទប់ស្កាត់មុខងារបទប្បញ្ញត្តិសំខាន់ៗរបស់វានៅក្នុងការឆ្លើយតបនៃប្រតិចារិក GA ខណៈពេលដែលរក្សាការរិចរិលរបស់វានៅលើការទទួលស្គាល់ GA ។ យើងបង្ហាញថា biosensor ផ្អែកលើការរិចរិលនេះកត់ត្រាយ៉ាងត្រឹមត្រូវនូវការផ្លាស់ប្តូរកម្រិត GA និងការចាប់សញ្ញាកោសិកាកំឡុងពេលអភិវឌ្ឍ។ យើងបានប្រើ biosensor នេះដើម្បីគូសផែនទីសកម្មភាពសញ្ញា GA នៅក្នុង SAM ។ យើងបង្ហាញថាសញ្ញា GA ខ្ពស់មានវត្តមានភាគច្រើននៅក្នុងកោសិកាដែលស្ថិតនៅចន្លោះសរីរាង្គ primordia ដែលជាបុព្វហេតុនៃកោសិកា internode ។ ដោយប្រើវិធីសាស្រ្តចំណេញ និងការបាត់បង់មុខងារ យើងបង្ហាញបន្ថែមទៀតថា GA គ្រប់គ្រងការតំរង់ទិសនៃយន្តហោះការបែងចែកកោសិកា ដោយបង្កើតអង្គការកោសិកា Canonical នៃ internodes ដោយហេតុនេះការលើកកម្ពស់ការបញ្ជាក់នៃ internode នៅក្នុង SAM ។
ពន្លក apical meristem (SAM) ដែលមានទីតាំងនៅចុងពន្លក មានកោសិកាដើមដែលសកម្មភាពរបស់វាបង្កើតសរីរាង្គនៅពេលក្រោយ និងថ្នាំងដើមក្នុងលក្ខណៈម៉ូឌុល និងដដែលៗពេញមួយជីវិតរបស់រុក្ខជាតិ។ ឯកតាដដែលៗទាំងនេះ ឬថ្នាំងរុក្ខជាតិនីមួយៗ រួមមាន internodes និងសរីរាង្គក្រោយៗនៅថ្នាំង និង axillary meristems នៅក្នុង axils ស្លឹក 1. ការលូតលាស់ និងការរៀបចំថ្នាំងរុក្ខជាតិផ្លាស់ប្តូរកំឡុងពេលអភិវឌ្ឍ។ នៅក្នុង Arabidopsis ការលូតលាស់ internodal ត្រូវបានបង្ក្រាបក្នុងដំណាក់កាលលូតលាស់ ហើយ axillary meristems នៅតែស្ងប់ស្ងាត់នៅក្នុង axils នៃស្លឹក rosette ។ ក្នុងអំឡុងពេលនៃការផ្លាស់ប្តូរទៅដំណាក់កាលផ្កា SAM ក្លាយជា inflorescence meristem បង្កើត internodes ពន្លូត និង axillary buds សាខានៅ axils នៃស្លឹក cauline និងក្រោយមកទៀត leafless flower2 ។ ទោះបីជាយើងមានការវិវឌ្ឍន៍គួរឱ្យកត់សម្គាល់ក្នុងការយល់ដឹងអំពីយន្តការដែលគ្រប់គ្រងការចាប់ផ្តើមនៃស្លឹក ផ្កា និងមែកក៏ដោយ ក៏គេដឹងតិចតួចណាស់អំពីរបៀបដែល internodes កើតឡើង។
ការយល់ដឹងអំពីការបែងចែក spatiotemporal នៃ GAs នឹងជួយឱ្យយល់កាន់តែច្បាស់អំពីមុខងាររបស់អរម៉ូនទាំងនេះនៅក្នុងជាលិកាផ្សេងៗគ្នា និងនៅដំណាក់កាលអភិវឌ្ឍន៍ផ្សេងៗគ្នា។ ការមើលឃើញនៃការរិចរិលនៃការលាយបញ្ចូលគ្នា RGA-GFP ដែលបង្ហាញនៅក្រោមសកម្មភាពរបស់អ្នកផ្សព្វផ្សាយផ្ទាល់របស់វាផ្តល់នូវព័ត៌មានសំខាន់ៗស្តីពីបទប្បញ្ញត្តិនៃកម្រិត GA សរុបនៅក្នុង roots15,16 ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយការបញ្ចេញមតិ RGA ប្រែប្រួលនៅទូទាំងជាលិកា 17 ហើយត្រូវបានគ្រប់គ្រងដោយ GA18 ។ ដូច្នេះ ការបញ្ចេញមតិឌីផេរ៉ង់ស្យែលរបស់អ្នកផ្សព្វផ្សាយ RGA អាចបណ្តាលឱ្យមានលំនាំ fluorescence ដែលបានសង្កេតជាមួយ RGA-GFP ហើយដូច្នេះវិធីសាស្ត្រនេះមិនមែនជាបរិមាណទេ។ ថ្មីៗនេះ fluorescein bioactive (Fl) ដែលមានស្លាក GA19,20 បានបង្ហាញពីការប្រមូលផ្តុំ GA នៅក្នុងឫស endocortex និងបទប្បញ្ញត្តិនៃកម្រិតកោសិការបស់វាដោយការដឹកជញ្ជូន GA ។ ថ្មីៗនេះ ឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា GA FRET nlsGPS1 បានបង្ហាញថា កម្រិត GA ទាក់ទងទៅនឹងការពន្លូតកោសិកានៅក្នុងឫស សរសៃ និង hypocotyls 21 ដែលលូតលាស់ងងឹត។ ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយ ដូចដែលយើងបានឃើញ ការប្រមូលផ្តុំ GA មិនមែនជាប៉ារ៉ាម៉ែត្រតែមួយគត់ដែលគ្រប់គ្រងសកម្មភាពសញ្ញា GA ទេព្រោះវាអាស្រ័យលើដំណើរការស្មុគ្រស្មាញ។ នៅទីនេះ ការកសាងលើការយល់ដឹងរបស់យើងអំពីផ្លូវផ្តល់សញ្ញា DELLA និង GA យើងរាយការណ៍ពីការអភិវឌ្ឍន៍ និងលក្ខណៈនៃ biosensor សមាមាត្រដែលផ្អែកលើការរិចរិលសម្រាប់ការផ្តល់សញ្ញា GA ។ ដើម្បីបង្កើត biosensor បរិមាណនេះ យើងបានប្រើ GA-sensitive RGA ដែលត្រូវបានបំប្លែងទៅជាប្រូតេអ៊ីន fluorescent និងបង្ហាញជាយថាហេតុនៅក្នុងជាលិកា ក៏ដូចជា GA-insensitive fluorescent protein។ យើងបង្ហាញថាការលាយប្រូតេអ៊ីន RGA ផ្លាស់ប្តូរមិនជ្រៀតជ្រែកជាមួយការបញ្ជូនសញ្ញា GA ដែលមិនដំណើរការទេនៅពេលដែលត្រូវបានបង្ហាញជាសកល ហើយថា biosensor នេះអាចកំណត់បរិមាណសកម្មភាពសញ្ញាដែលបណ្តាលមកពីទាំងការបញ្ចូល GA និងដំណើរការសញ្ញា GA ដោយឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាជាមួយនឹងដំណោះស្រាយ spatiotemporal ខ្ពស់។ យើងបានប្រើ biosensor នេះដើម្បីគូសផែនទីការចែកចាយ spatiotemporal នៃសកម្មភាពផ្តល់សញ្ញា GA និងកំណត់បរិមាណពីរបៀបដែល GA គ្រប់គ្រងឥរិយាបថកោសិកានៅក្នុង SAM epidermis ។ យើងបង្ហាញថា GA ធ្វើនិយ័តកម្មការតំរង់ទិសនៃការបែងចែកនៃកោសិកា SAM ដែលស្ថិតនៅចន្លោះសរីរាង្គ primordia ដោយហេតុនេះកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធកោសិកា Canonical នៃ internode ។
ជាចុងក្រោយ យើងបានសួរថាតើ qmRGA អាចរាយការណ៍ពីការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុងកម្រិត GA endogenous ដោយប្រើ hypocotyls ដែលកំពុងលូតលាស់ដែរឬទេ។ យើងបានបង្ហាញពីមុនថា nitrate ជំរុញការលូតលាស់ដោយការបង្កើនការសំយោគ GA ហើយផ្ទុយទៅវិញ ការរិចរិល DELLA34 ។ អាស្រ័យហេតុនេះ យើងបានសង្កេតឃើញថា ប្រវែង hypocotyl នៅក្នុង pUBQ10::qmRGA សំណាបដែលលូតលាស់ក្រោមការផ្គត់ផ្គង់ nitrate ច្រើនក្រៃលែង (10 mM NO3−) គឺវែងជាងយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុងសំណាបដែលដាំដុះក្រោមលក្ខខណ្ឌកង្វះ nitrate (រូបភាពបន្ថែម 6a) ។ ស្របជាមួយនឹងការឆ្លើយតបនៃការលូតលាស់ សញ្ញា GA គឺខ្ពស់ជាងនៅក្នុង hypocotyls នៃសំណាបដែលលូតលាស់ក្រោមលក្ខខណ្ឌ 10 mM NO3− ជាងនៅក្នុងសំណាបដែលដាំដុះដោយគ្មានជាតិនីត្រាត (រូបភាពបន្ថែម 6b, គ)។ ដូច្នេះ qmRGA ក៏អនុញ្ញាតឱ្យត្រួតពិនិត្យការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុងសញ្ញា GA ដែលបណ្តាលមកពីការផ្លាស់ប្តូរ endogenous នៅក្នុងកំហាប់ GA ។
ដើម្បីយល់ថាតើសកម្មភាពសញ្ញា GA ដែលបានរកឃើញដោយ qmRGA អាស្រ័យលើការផ្តោតអារម្មណ៍ GA និងការយល់ឃើញរបស់ GA ដូចដែលបានរំពឹងទុកដោយផ្អែកលើការរចនាឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា យើងបានវិភាគការបញ្ចេញមតិរបស់អ្នកទទួល GID1 ទាំងបីនៅក្នុងជាលិកាលូតលាស់ និងបន្តពូជ។ នៅក្នុងសំណាប បន្ទាត់អ្នកយកព័ត៌មាន GID1-GUS បានបង្ហាញថា GID1a និង c ត្រូវបានបង្ហាញយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុង cotyledons (រូបភាព 3a–c) ។ លើសពីនេះទៀត អ្នកទទួលទាំងបីត្រូវបានបង្ហាញជាស្លឹក ឫសគល់នៅពេលក្រោយ ឫសគល់ (លើកលែងតែឫសគល់នៃ GID1b) និងប្រព័ន្ធសរសៃឈាម (រូបភាព 3a–c)។ នៅក្នុង inflorescence SAM យើងបានរកឃើញសញ្ញា GUS សម្រាប់តែ GID1b និង 1c (រូបភាពបន្ថែម 7a–c)។ In situ hybridization បានបញ្ជាក់ពីគំរូនៃការបញ្ចេញមតិទាំងនេះ ហើយបានបង្ហាញបន្ថែមទៀតថា GID1c ត្រូវបានបង្ហាញស្មើភាពគ្នានៅកម្រិតទាបនៅក្នុង SAM ចំណែកឯ GID1b បានបង្ហាញការបញ្ចេញមតិខ្ពស់ជាងនៅបរិវេណនៃ SAM (រូបភាពបន្ថែម 7d–l)។ ការលាយបញ្ចូលគ្នានៃការបកប្រែ pGID1b::2xmTQ2-GID1b ក៏បានបង្ហាញពីជួរកម្រិតនៃកន្សោម GID1b ពីកន្សោមទាប ឬគ្មាននៅកណ្តាល SAM ដល់កន្សោមខ្ពស់នៅព្រំដែនសរីរាង្គ (រូបភាពបន្ថែម 7m)។ ដូច្នេះ អ្នកទទួល GID1 មិនត្រូវបានចែកចាយស្មើៗគ្នានៅទូទាំង និងក្នុងជាលិកាទេ។ នៅក្នុងការពិសោធន៍ជាបន្តបន្ទាប់ យើងក៏បានសង្កេតឃើញថា ការបង្ហាញហួសកម្រិតនៃ GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) បានបង្កើនភាពប្រែប្រួលនៃ qmRGA នៅក្នុង hypocotyls ទៅនឹងកម្មវិធី GA ខាងក្រៅ (រូបភាព 3d, e)។ ផ្ទុយទៅវិញ fluorescence ដែលវាស់វែងដោយ qd17mRGA ក្នុង hypocotyl គឺមិនមានប្រតិកម្មចំពោះការព្យាបាល GA3 (រូបភាព 3f, g) ។ សម្រាប់ការវាយតម្លៃទាំងពីរ សំណាបត្រូវបានព្យាបាលដោយកំហាប់ខ្ពស់នៃ GA (100 μM GA3) ដើម្បីវាយតម្លៃឥរិយាបថរហ័សរបស់ឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា ដែលសមត្ថភាពក្នុងការចងភ្ជាប់ទៅនឹងអ្នកទទួល GID1 ត្រូវបានពង្រឹង ឬបាត់បង់។ ជាមួយគ្នា លទ្ធផលទាំងនេះបញ្ជាក់ថា ឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា qmRGA បម្រើមុខងាររួមបញ្ចូលគ្នាជាឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា GA និង GA ហើយណែនាំថា ការបញ្ចេញមតិឌីផេរ៉ង់ស្យែលរបស់ឧបករណ៍ទទួល GID1 អាចកែប្រែការសាយភាយរបស់ឧបករណ៍ចាប់សញ្ញាបានយ៉ាងសំខាន់។
រហូតមកដល់ពេលនេះការចែកចាយសញ្ញា GA នៅក្នុង SAM នៅតែមិនច្បាស់លាស់។ ដូច្នេះហើយ យើងបានប្រើរុក្ខជាតិបង្ហាញ qmRGA និង pCLV3::mCherry-NLS stem cell reporter35 ដើម្បីគណនាផែនទីបរិមាណគុណភាពបង្ហាញខ្ពស់នៃសកម្មភាពផ្តល់សញ្ញា GA ដោយផ្តោតលើស្រទាប់ L1 (epidermis; រូបភាពទី 4a, b សូមមើល វិធីសាស្រ្ត និងវិធីសាស្រ្តបន្ថែមនៃការគ្រប់គ្រង) ចាប់តាំងពីការលូតលាស់របស់ L16 S. នៅទីនេះ pCLV3::mCherry-NLS កន្សោមបានផ្តល់ចំណុចយោងធរណីមាត្រថេរសម្រាប់ការវិភាគការបែងចែក spatiotemporal នៃសកម្មភាពសញ្ញា GA37 ។ ទោះបីជា GA ត្រូវបានគេចាត់ទុកថាមានសារៈសំខាន់សម្រាប់ការអភិវឌ្ឍសរីរាង្គនៅពេលក្រោយ 4 ក៏ដោយ យើងបានសង្កេតឃើញថា សញ្ញា GA មានកម្រិតទាបនៅក្នុង floral primordium (P) ដែលចាប់ផ្តើមពីដំណាក់កាល P3 (រូបភាព 4a, b) ចំណែកឯ primordiums វ័យក្មេង P1 និង P2 មានសកម្មភាពមធ្យមស្រដៀងទៅនឹងតំបន់កណ្តាល (រូបភាព 4a, ខ)។ សកម្មភាពសញ្ញា GA កាន់តែខ្ពស់ត្រូវបានរកឃើញនៅព្រំដែន primordium សរីរាង្គ ចាប់ផ្តើមនៅ P1/P2 (នៅជ្រុងនៃព្រំដែន) និងកំពូលនៅ P4 ក៏ដូចជានៅក្នុងកោសិកាទាំងអស់នៃតំបន់គ្រឿងកុំព្យូទ័រដែលស្ថិតនៅចន្លោះ primordia (រូបភាព 4a, b និងបន្ថែមរូបភាព 8a, ខ)។ សកម្មភាពផ្តល់សញ្ញា GA ខ្ពស់ជាងនេះត្រូវបានគេសង្កេតឃើញមិនត្រឹមតែនៅក្នុង epidermis ប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែនៅក្នុងស្រទាប់ L2 និងខាងលើ L3 (រូបភាពបន្ថែម 8b) ។ គំរូនៃសញ្ញា GA ដែលបានរកឃើញនៅក្នុង SAM ដោយប្រើ qmRGA ក៏នៅតែមិនផ្លាស់ប្តូរតាមពេលវេលា (រូបភាពបន្ថែម 8c–f, k) ។ ទោះបីជាសំណង់ qd17mRGA ត្រូវបានកាត់បន្ថយជាប្រព័ន្ធនៅក្នុង SAM នៃរុក្ខជាតិ T3 ពីបន្ទាត់ឯករាជ្យចំនួន 5 ដែលយើងកំណត់លក្ខណៈដោយលម្អិតក៏ដោយ យើងអាចវិភាគគំរូ fluorescence ដែលទទួលបានជាមួយនឹងការសាងសង់ pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (រូបភាពបន្ថែម 8g–j, l) ។ នៅក្នុងបន្ទាត់ត្រួតពិនិត្យនេះ មានតែការផ្លាស់ប្តូរតិចតួចនៅក្នុងសមាមាត្រ fluorescence ប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុង SAM ប៉ុន្តែនៅក្នុងមជ្ឈមណ្ឌល SAM យើងបានសង្កេតឃើញការថយចុះយ៉ាងច្បាស់ និងមិនបានរំពឹងទុកនៅក្នុង VENUS ដែលទាក់ទងនឹង TagBFP ។ នេះបញ្ជាក់ថាគំរូសញ្ញាដែលបានសង្កេតដោយ qmRGA ឆ្លុះបញ្ចាំងពីការរិចរិលដែលពឹងផ្អែកលើ GA នៃ mRGA-VENUS ប៉ុន្តែក៏បង្ហាញថា qmRGA អាចប៉ាន់ស្មានសកម្មភាពសញ្ញា GA លើសនៅក្នុងមជ្ឈមណ្ឌល meristem ។ សរុបមក លទ្ធផលរបស់យើងបង្ហាញពីគំរូសញ្ញា GA ដែលឆ្លុះបញ្ចាំងជាចម្បងអំពីការចែកចាយ primordia ។ ការចែកចាយនៃតំបន់អន្តរបុព្វកាល (IPR) នេះគឺដោយសារតែការបង្កើតជាបណ្តើរៗនៃសកម្មភាពផ្តល់សញ្ញា GA ខ្ពស់រវាងតំបន់ primordium ដែលកំពុងអភិវឌ្ឍ និងតំបន់កណ្តាល ខណៈដែលក្នុងពេលជាមួយគ្នានោះ សកម្មភាពផ្តល់សញ្ញា GA នៅក្នុង primordium មានការថយចុះ (រូបភាព 4c, ឃ)។
ការចែកចាយ GID1b និង GID1c receptors (សូមមើលខាងលើ) បង្ហាញថាការបញ្ចេញមតិឌីផេរ៉ង់ស្យែលនៃ GA receptors ជួយបង្កើតគំរូនៃសកម្មភាពសញ្ញា GA នៅក្នុង SAM ។ យើងបានឆ្ងល់ថាតើការប្រមូលផ្តុំឌីផេរ៉ង់ស្យែលនៃ GA អាចពាក់ព័ន្ធឬអត់។ ដើម្បីស៊ើបអង្កេតលទ្ធភាពនេះ យើងបានប្រើឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា nlsGPS1 GA FRET21។ ការកើនឡើងប្រេកង់នៃការធ្វើឱ្យសកម្មត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុង SAM នៃ nlsGPS1 ដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ 10 μM GA4+7 សម្រាប់ 100 នាទី (រូបភាពបន្ថែម 9a–e) ដែលបង្ហាញថា nlsGPS1 ឆ្លើយតបទៅនឹងការផ្លាស់ប្តូរកំហាប់ GA នៅក្នុង SAM ដូចដែលវាកើតឡើងនៅក្នុង roots21 ។ ការចែកចាយលំហនៃប្រេកង់ធ្វើឱ្យសកម្ម nlsGPS1 បានបង្ហាញកម្រិត GA ទាបនៅក្នុងស្រទាប់ខាងក្រៅនៃ SAM ប៉ុន្តែបានបង្ហាញថាពួកគេត្រូវបានកើនឡើងនៅកណ្តាល និងនៅព្រំដែននៃ SAM (រូបភាព 4e និងរូបភាពបន្ថែម 9a, គ)។ នេះបង្ហាញថា GA ក៏ត្រូវបានចែកចាយនៅក្នុង SAM ជាមួយនឹងគំរូលំហដែលអាចប្រៀបធៀបទៅនឹងអ្វីដែលបានបង្ហាញដោយ qmRGA ។ ជាវិធីសាស្រ្តបំពេញបន្ថែម យើងក៏បានចាត់ទុក SAM ជាមួយនឹង fluorescent GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) ឬ Fl តែឯងជាការគ្រប់គ្រងអវិជ្ជមាន។ សញ្ញា Fl ត្រូវបានចែកចាយពាសពេញ SAM រួមទាំងតំបន់កណ្តាល និង primordium ទោះបីជាមានអាំងតង់ស៊ីតេទាបក៏ដោយ (រូបភាព 4j និងបន្ថែមរូបភាព 10 ឃ)។ ផ្ទុយទៅវិញ GA-Fl ទាំងបីបានប្រមូលផ្តុំជាពិសេសនៅក្នុងព្រំដែនបឋម និងដល់កម្រិតខុសគ្នានៅក្នុង IPR ដែលនៅសេសសល់ ដោយ GA7-Fl ប្រមូលផ្តុំនៅក្នុងដែនធំបំផុតនៅក្នុង IPR (រូបភាព 4k និងរូបភាពបន្ថែម 10a,b)។ បរិមាណនៃអាំងតង់ស៊ីតេ fluorescence បានបង្ហាញថាសមាមាត្រអាំងតង់ស៊ីតេ IPR ទៅមិនមែន IPR គឺខ្ពស់ជាងនៅក្នុង SAM ដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ GA-Fl បើប្រៀបធៀបទៅនឹង Fl-treated SAM (រូបភាព 4l និងរូបភាពបន្ថែម 10c) ។ ជាមួយគ្នា លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថា GA មានវត្តមាននៅកំហាប់ខ្ពស់នៅក្នុងកោសិកា IPR ដែលមានទីតាំងនៅជិតព្រំដែនសរីរាង្គបំផុត។ នេះបង្ហាញថាគំរូនៃសកម្មភាពសញ្ញា SAM GA កើតឡើងពីការបញ្ចេញមតិឌីផេរ៉ង់ស្យែលនៃអ្នកទទួល GA និងការប្រមូលផ្តុំឌីផេរ៉ង់ស្យែលនៃ GA នៅក្នុងកោសិកា IPR នៅជិតព្រំដែនសរីរាង្គ។ ដូច្នេះ ការវិភាគរបស់យើងបានបង្ហាញពីគំរូនៃសញ្ញា GA ដែលមិនបានរំពឹងទុកជាមួយនឹងសកម្មភាពទាបជាងនៅកណ្តាល និងបឋមនៃ SAM និងសកម្មភាពខ្ពស់ជាងនៅក្នុង IPR នៅក្នុងតំបន់គ្រឿងកុំព្យូទ័រ។
ដើម្បីយល់ពីតួនាទីនៃសកម្មភាពសញ្ញា GA ឌីផេរ៉ង់ស្យែលនៅក្នុង SAM យើងបានវិភាគទំនាក់ទំនងរវាងសកម្មភាពផ្តល់សញ្ញា GA ការពង្រីកកោសិកា និងការបែងចែកកោសិកាដោយប្រើរូបភាពពេលវេលាជាក់ស្តែងនៃ SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS ។ ដោយសារតួនាទីរបស់ GA ក្នុងបទប្បញ្ញត្តិកំណើន ទំនាក់ទំនងវិជ្ជមានជាមួយប៉ារ៉ាម៉ែត្រពង្រីកកោសិកាត្រូវបានរំពឹងទុក។ ដូច្នេះដំបូង យើងបានប្រៀបធៀបផែនទីសកម្មភាពផ្តល់សញ្ញា GA ជាមួយនឹងផែនទីនៃអត្រាកំណើនផ្ទៃក្រឡា (ជាប្រូកស៊ីសម្រាប់ភាពរឹងមាំនៃការពង្រីកកោសិកាសម្រាប់កោសិកាដែលបានផ្តល់ឱ្យ និងសម្រាប់កោសិកាកូនស្រីនៅពេលបែងចែក) និងជាមួយផែនទីនៃការលូតលាស់ anisotropy ដែលវាស់ទិសដៅនៃការពង្រីកកោសិកា (ត្រូវបានគេប្រើផងដែរនៅទីនេះសម្រាប់កោសិកាដែលបានផ្តល់ឱ្យ និងសម្រាប់កោសិកាកូនស្រីនៅឯការបែងចែក។ ផែនទីរបស់យើងនៃអត្រាកំណើនផ្ទៃក្រឡា SAM គឺស្របជាមួយនឹងការសង្កេតពីមុន 38,39 ជាមួយនឹងអត្រាកំណើនតិចតួចបំផុតនៅព្រំដែន និងអត្រាកំណើនអតិបរមាក្នុងការអភិវឌ្ឍផ្កា (រូបភាព 5a) ។ ការវិភាគសមាសធាតុចម្បង (PCA) បានបង្ហាញថាសកម្មភាពនៃសញ្ញា GA ត្រូវបានជាប់ទាក់ទងអវិជ្ជមានជាមួយអាំងតង់ស៊ីតេនៃការលូតលាស់កោសិកា (រូបភាព 5c) ។ យើងក៏បានបង្ហាញផងដែរថាអ័ក្សសំខាន់នៃបំរែបំរួល រួមទាំងការបញ្ចូលសញ្ញា GA និងអាំងតង់ស៊ីតេនៃការលូតលាស់ គឺស្របទៅនឹងទិសដៅដែលកំណត់ដោយកន្សោម CLV3 ខ្ពស់ ដោយបញ្ជាក់ពីការដកកោសិកាចេញពីមជ្ឈមណ្ឌល SAM នៅក្នុងការវិភាគដែលនៅសល់។ ការវិភាគទំនាក់ទំនង Spearman បានបញ្ជាក់ពីលទ្ធផល PCA (រូបភាពទី 5d) ដែលបង្ហាញថាសញ្ញា GA ខ្ពស់ជាងនៅក្នុង IPR មិនបណ្តាលឱ្យមានការពង្រីកកោសិកាខ្ពស់ជាងនេះទេ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការវិភាគទំនាក់ទំនងបានបង្ហាញពីទំនាក់ទំនងវិជ្ជមានបន្តិចបន្តួចរវាងសកម្មភាពផ្តល់សញ្ញា GA និងការលូតលាស់ anisotropy (រូបភាព 5c, ឃ) ដែលបង្ហាញថា សញ្ញា GA ខ្ពស់ជាងនៅក្នុង IPR មានឥទ្ធិពលលើទិសដៅនៃការលូតលាស់កោសិកា និងអាចជាទីតាំងនៃយន្តហោះបែងចែកកោសិកា។
a, b ផែនទីកំដៅនៃការលូតលាស់ផ្ទៃមធ្យម (a) និងការលូតលាស់ anisotropy (b) នៅក្នុង SAM ជាមធ្យមលើរុក្ខជាតិឯករាជ្យចំនួនប្រាំពីរ (ប្រើជាប្រូកស៊ីសម្រាប់កម្លាំង និងទិសដៅនៃការពង្រីកកោសិការៀងៗខ្លួន)។ c ការវិភាគ PCA រួមបញ្ចូលអថេរដូចខាងក្រោមៈ សញ្ញា GA អាំងតង់ស៊ីតេនៃការលូតលាស់ផ្ទៃ ការលូតលាស់លើផ្ទៃ anisotropy និងកន្សោម CLV3 ។ សមាសធាតុ PCA 1 ត្រូវបានទាក់ទងអវិជ្ជមានជាចម្បងជាមួយអាំងតង់ស៊ីតេនៃការលូតលាស់ផ្ទៃ និងជាប់ទាក់ទងជាវិជ្ជមានជាមួយសញ្ញា GA ។ សមាសធាតុ PCA 2 ត្រូវបានជាប់ទាក់ទងជាវិជ្ជមានជាមួយ anisotropy ការលូតលាស់លើផ្ទៃ ហើយជាប់ទាក់ទងអវិជ្ជមានជាមួយកន្សោម CLV3 ។ ភាគរយតំណាងឱ្យបំរែបំរួលដែលបានពន្យល់ដោយសមាសធាតុនីមួយៗ។ d Spearman ការវិភាគទំនាក់ទំនងរវាងសញ្ញា GA អាំងតង់ស៊ីតេនៃការលូតលាស់លើផ្ទៃ និង anisotropy ការលូតលាស់លើផ្ទៃនៃមាត្រដ្ឋានជាលិកាដោយមិនរាប់បញ្ចូល CZ ។ លេខនៅខាងស្តាំគឺជាតម្លៃ Spearman rho រវាងអថេរពីរ។ សញ្ញាផ្កាយបង្ហាញពីករណីដែលការជាប់ទាក់ទងគ្នា/ទំនាក់ទំនងអវិជ្ជមានមានសារៈសំខាន់ខ្លាំង។ e ការមើលឃើញ 3D នៃកោសិកា Col-0 SAM L1 ដោយមីក្រូទស្សន៍បង្រួម។ ជញ្ជាំងកោសិកាថ្មីដែលបានបង្កើតឡើងនៅក្នុង SAM (ប៉ុន្តែមិនមែនជាបឋម) នៅ 10 ម៉ោងត្រូវបានលាបពណ៌តាមតម្លៃមុំរបស់វា។ របារពណ៌ត្រូវបានបង្ហាញនៅជ្រុងខាងស្តាំខាងក្រោម។ ធាតុបញ្ចូលបង្ហាញរូបភាព 3D ដែលត្រូវគ្នានៅម៉ោង 0 ម៉ោង។ ការពិសោធន៍ត្រូវបានធ្វើម្តងទៀតពីរដងជាមួយនឹងលទ្ធផលស្រដៀងគ្នា។ f ប្លង់ប្រអប់បង្ហាញអត្រាការបែងចែកកោសិកាក្នុង IPR និងមិនមែន IPR Col-0 SAM (n = 10 រុក្ខជាតិឯករាជ្យ)។ បន្ទាត់កណ្តាលបង្ហាញពីមធ្យម ហើយព្រំដែនប្រអប់បង្ហាញពីភាគរយទី 25 និង 75 ។ Whiskers បង្ហាញពីតម្លៃអប្បបរមា និងអតិបរមាដែលកំណត់ជាមួយកម្មវិធី R ។ តម្លៃ P ត្រូវបានទទួលជាមួយនឹងការធ្វើតេស្ត t-tailed ពីររបស់ Welch ។ g, h ដ្យាក្រាមគ្រោងការណ៍ដែលបង្ហាញ (g) របៀបវាស់មុំនៃជញ្ជាំងកោសិកាថ្មី (ពណ៌ស្វាយ) ទាក់ទងទៅនឹងទិសដៅរ៉ាឌីកាល់ពីកណ្តាល SAM (បន្ទាត់ចំនុចពណ៌ស) (មានតែតម្លៃមុំស្រួច ពោលគឺ 0-90° ប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានពិចារណា) និង (h) ទិសរង្វង់/ក្រោយ និងរ៉ាឌីកាល់នៅក្នុង meristem ។ i អ៊ីស្តូក្រាមប្រេកង់នៃការតំរង់ទិសយន្តហោះបែងចែកកោសិកាឆ្លងកាត់ SAM (ពណ៌ខៀវងងឹត), IPR (ពណ៌ខៀវមធ្យម) និងមិនមែន IPR (ពណ៌ខៀវខ្ចី) រៀងគ្នា។ តម្លៃ P ត្រូវបានទទួលដោយការធ្វើតេស្ត Kolmogorov-Smirnov ដែលមានកន្ទុយពីរ។ ការពិសោធន៍ត្រូវបានធ្វើម្តងទៀតពីរដងជាមួយនឹងលទ្ធផលស្រដៀងគ្នា។ j អ៊ីស្តូក្រាមប្រេកង់នៃការតំរង់ទិសយន្តហោះបែងចែកកោសិកានៃ IPR ជុំវិញ P3 (ពណ៌បៃតងខ្ចី) P4 (បៃតងមធ្យម) និង P5 (ពណ៌បៃតងងងឹត) រៀងគ្នា។ តម្លៃ P ត្រូវបានទទួលដោយការធ្វើតេស្ត Kolmogorov-Smirnov ដែលមានកន្ទុយពីរ។ ការពិសោធន៍ត្រូវបានធ្វើម្តងទៀតពីរដងជាមួយនឹងលទ្ធផលស្រដៀងគ្នា។
ដូច្នេះ យើងបានស៊ើបអង្កេតបន្ទាប់ទៀតអំពីទំនាក់ទំនងរវាងការបញ្ជូនសញ្ញា GA និងសកម្មភាពការបែងចែកកោសិកា ដោយកំណត់អត្តសញ្ញាណជញ្ជាំងកោសិកាដែលទើបបង្កើតថ្មីកំឡុងពេលធ្វើតេស្ត (រូបភាព 5e)។ វិធីសាស្រ្តនេះបានអនុញ្ញាតឱ្យយើងវាស់ប្រេកង់ និងទិសដៅនៃការបែងចែកកោសិកា។ គួរឱ្យភ្ញាក់ផ្អើល យើងបានរកឃើញថាភាពញឹកញាប់នៃការបែងចែកកោសិកានៅក្នុង IPR និង SAM ដែលនៅសល់ (មិនមែន IPR រូបភព 5f) គឺស្រដៀងគ្នា ដែលបង្ហាញថាភាពខុសគ្នានៃសញ្ញា GA រវាងកោសិកា IPR និងមិនមែន IPR មិនប៉ះពាល់ដល់ការបែងចែកកោសិកាខ្លាំងនោះទេ។ នេះ និងការជាប់ទាក់ទងគ្នាជាវិជ្ជមានរវាងសញ្ញា GA និងការលូតលាស់ anisotropy បានជំរុញឱ្យយើងពិចារណាថាតើសកម្មភាពនៃសញ្ញា GA អាចមានឥទ្ធិពលលើការតំរង់ទិសនៃយន្តហោះការបែងចែកកោសិកា។ យើងបានវាស់ការតំរង់ទិសនៃជញ្ជាំងកោសិកាថ្មីជាមុំស្រួចដែលទាក់ទងទៅនឹងអ័ក្សរ៉ាឌីកាល់ដែលតភ្ជាប់មជ្ឈមណ្ឌល meristem និងកណ្តាលនៃជញ្ជាំងកោសិកាថ្មី (រូបភាព 5e-i) ហើយបានសង្កេតឃើញទំនោរច្បាស់លាស់សម្រាប់កោសិកាដើម្បីបែងចែកនៅមុំជិត 90° ទាក់ទងទៅនឹងអ័ក្សរ៉ាឌីកាល់ ជាមួយនឹងប្រេកង់ខ្ពស់បំផុតត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅ 70–80° (90°–80%) និង 90°–80°។ (22.62%) (រូបទី 5e,i) ដែលត្រូវគ្នាទៅនឹងការបែងចែកកោសិកាក្នុងទិសដៅ circumferential/transverse (រូបភាព 5h)។ ដើម្បីពិនិត្យមើលការរួមចំណែកនៃសញ្ញា GA ទៅនឹងឥរិយាបថនៃការបែងចែកកោសិកានេះ យើងបានវិភាគប៉ារ៉ាម៉ែត្រនៃការបែងចែកកោសិកានៅក្នុង IPR និងមិនមែន IPR ដាច់ដោយឡែកពីគ្នា (រូបភាព 5i)។ យើងបានសង្កេតឃើញថាការបែងចែកមុំបែងចែកនៅក្នុងកោសិកា IPR ខុសគ្នាពីកោសិកាដែលមិនមែនជា IPR ឬនៅក្នុងកោសិកានៅក្នុង SAM ទាំងមូល ដោយកោសិកា IPR បង្ហាញសមាមាត្រខ្ពស់ជាងនៃការបែងចែកកោសិកានៅពេលក្រោយ/រាងជារង្វង់ ពោលគឺ 70–80° និង 80–90° (33.86% និង 30.71% រៀងគ្នាសមាមាត្រ 5) ។ ដូច្នេះ ការសង្កេតរបស់យើងបានបង្ហាញពីការផ្សារភ្ជាប់គ្នារវាងការបញ្ជូនសញ្ញា GA ខ្ពស់ និងការតំរង់ទិសយន្តហោះបែងចែកកោសិកានៅជិតទិសរង្វង់មូល ដែលស្រដៀងទៅនឹងទំនាក់ទំនងរវាងសកម្មភាពផ្តល់សញ្ញា GA និងការលូតលាស់ anisotropy (រូបភាព 5c, ឃ)។ ដើម្បីបង្កើតការអភិរក្សលំហនៃសមាគមនេះបន្ថែមទៀត យើងបានវាស់ស្ទង់ការបែងចែកទិសនៃយន្តហោះនៅក្នុងកោសិកា IPR ជុំវិញ primordium ចាប់ផ្តើមពី P3 ចាប់តាំងពីសកម្មភាពសញ្ញា GA ខ្ពស់បំផុតត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងតំបន់នេះដោយចាប់ផ្តើមពី P4 (រូបភាព 4) ។ មុំបែងចែកនៃ IPR ជុំវិញ P3 និង P4 មិនបង្ហាញពីភាពខុសប្លែកគ្នាជាស្ថិតិទេ ទោះបីជាការកើនឡើងនៃប្រេកង់នៃការបែងចែកកោសិកានៅពេលក្រោយត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុង IPR ជុំវិញ P4 (រូបភាព 5j) ក៏ដោយ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយនៅក្នុងកោសិកា IPR ជុំវិញ P5 ភាពខុសគ្នានៃការតំរង់ទិសនៃយន្តហោះការបែងចែកកោសិកាបានក្លាយជាស្ថិតិគួរឱ្យកត់សម្គាល់ជាមួយនឹងការកើនឡើងយ៉ាងខ្លាំងនៃប្រេកង់នៃការបែងចែកកោសិកាឆ្លងកាត់ (រូបភាព 5j) ។ ជាមួយគ្នា លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថា សញ្ញា GA អាចគ្រប់គ្រងការតំរង់ទិសនៃការបែងចែកកោសិកានៅក្នុង SAM ដែលស្របនឹងរបាយការណ៍មុន 40,41 ដែលសញ្ញា GA ខ្ពស់អាចបណ្តាលឱ្យមានការតំរង់ទិសនៅពេលក្រោយនៃការបែងចែកកោសិកានៅក្នុង IPR ។
វាត្រូវបានព្យាករណ៍ថាកោសិកានៅក្នុង IPR នឹងមិនត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុង primordia ទេ ប៉ុន្តែផ្ទុយទៅវិញចូលទៅក្នុង internodes2,42,43។ ការតំរង់ទិសឆ្លងកាត់នៃការបែងចែកកោសិកានៅក្នុង IPR អាចបណ្តាលឱ្យមានអង្គការធម្មតានៃជួរបណ្តោយស្របគ្នានៃកោសិកាអេពីដេមនៅក្នុងចន្លោះ។ ការសង្កេតរបស់យើងដែលបានពិពណ៌នាខាងលើបង្ហាញថា សញ្ញា GA ទំនងជាដើរតួក្នុងដំណើរការនេះដោយធ្វើនិយតកម្មទិសដៅនៃការបែងចែកកោសិកា។
ការបាត់បង់មុខងារនៃហ្សែន DELLA ជាច្រើនបណ្តាលឱ្យមានការឆ្លើយតប GA ដែលជាធាតុផ្សំ ហើយ della mutants អាចត្រូវបានប្រើដើម្បីសាកល្បងសម្មតិកម្ម 44 នេះ។ ដំបូងយើងបានវិភាគគំរូនៃការបញ្ចេញមតិនៃហ្សែន DELLA ចំនួនប្រាំនៅក្នុង SAM ។ ការលាយបញ្ចូលប្រតិចារិកនៃ GUS line45 បានបង្ហាញថា GAI, RGA, RGL1, និង RGL2 (ក្នុងកម្រិតតិចជាងច្រើន) ត្រូវបានបង្ហាញនៅក្នុង SAM (រូបភាពបន្ថែម 11a–d) ។ ការបង្កាត់នៅក្នុងទីតាំងបានបង្ហាញបន្ថែមទៀតថា GAI mRNA ប្រមូលផ្តុំជាពិសេសនៅក្នុង primordia និងការអភិវឌ្ឍផ្កា (រូបភាពបន្ថែម 11e) ។ RGL1 និង RGL3 mRNA ត្រូវបានគេរកឃើញពាសពេញដើម SAM និងនៅក្នុងផ្កាចាស់ៗ ចំណែកឯ RGL2 mRNA មានច្រើននៅក្នុងតំបន់ព្រំដែន (រូបភាពបន្ថែម 11f–h)។ ការថតរូបភាពនៃ pRGL3::RGL3-GFP SAM បានបញ្ជាក់ពីកន្សោមដែលសង្កេតឃើញដោយការបង្កាត់នៅក្នុងកន្លែង ហើយបានបង្ហាញថាប្រូតេអ៊ីន RGL3 កកកុញនៅផ្នែកកណ្តាលនៃ SAM (រូបភាពបន្ថែម 11i)។ ដោយប្រើបន្ទាត់ pRGA::GFP-RGA យើងក៏បានរកឃើញថាប្រូតេអ៊ីន RGA ប្រមូលផ្តុំនៅក្នុង SAM ប៉ុន្តែភាពសម្បូរបែបរបស់វាថយចុះនៅព្រំដែនដែលចាប់ផ្តើមពី P4 (រូបភាពបន្ថែម 11j)។ គួរកត់សំគាល់ គំរូនៃការបញ្ចេញមតិរបស់ RGL3 និង RGA គឺស្របជាមួយនឹងសកម្មភាពផ្តល់សញ្ញា GA ខ្ពស់ជាងនៅក្នុង IPR ដូចដែលបានរកឃើញដោយ qmRGA (រូបភាពទី 4)។ ជាងនេះទៅទៀត ទិន្នន័យទាំងនេះបង្ហាញថា DELLA ទាំងអស់ត្រូវបានបង្ហាញនៅក្នុង SAM ហើយថាកន្សោមរបស់ពួកគេរួមជាមួយនឹង SAM ទាំងមូល។
បន្ទាប់យើងធ្វើការវិភាគលើប៉ារ៉ាម៉ែត្រនៃការបែងចែកកោសិកានៅក្នុងប្រភេទ Wild-type SAM (Ler, control) និង gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) mutants (រូបភាព 6a, b)។ គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ យើងបានសង្កេតឃើញការផ្លាស់ប្តូរយ៉ាងសំខាន់ក្នុងស្ថិតិក្នុងការចែកចាយប្រេកង់មុំនៃការបែងចែកកោសិកានៅក្នុង della global mutant SAM បើប្រៀបធៀបទៅនឹងប្រភេទសត្វព្រៃ (រូបភាព 6c) ។ ការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុង della global mutant គឺដោយសារតែការកើនឡើងនៃប្រេកង់នៃមុំ 80–90° (34.71% ទល់នឹង 24.55%) និងក្នុងកម្រិតតិចជាង 70–80° មុំ (23.78% ទល់នឹង 20.18%) ពោលគឺត្រូវគ្នាទៅនឹងការបែងចែកកោសិកាឆ្លងកាត់ (6c) ។ ភាពញឹកញាប់នៃការបែងចែកមិនឆ្លង (0–60°) ក៏ទាបជាងនៅក្នុង della global mutant (រូបភាព 6c)។ ភាពញឹកញាប់នៃការបែងចែកកោសិកាឆ្លងកាត់ត្រូវបានកើនឡើងយ៉ាងខ្លាំងនៅក្នុង SAM នៃ della global mutant (រូបភាព 6b) ។ ភាពញឹកញាប់នៃការបែងចែកកោសិកាឆ្លងកាត់ក្នុង IPR ក៏ខ្ពស់ជាងនៅក្នុង della global mutant បើប្រៀបធៀបទៅនឹងប្រភេទព្រៃ (រូបភាព 6d)។ នៅខាងក្រៅតំបន់ IPR ប្រភេទព្រៃមានការចែកចាយឯកសណ្ឋានបន្ថែមទៀតនៃមុំបែងចែកកោសិកា ចំណែកឯ della global mutant ចូលចិត្តការបែងចែកតង់សង់ដូចជា IPR (រូបភាព 6e)។ យើងក៏បានកំណត់បរិមាណការតំរង់ទិសនៃការបែងចែកកោសិកានៅក្នុង SAM នៃ ga2 oxidase (ga2ox) quintuple mutants (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, និង ga2ox6-2) ដែលជាផ្ទៃខាងក្រោយ GA-អសកម្ម mutant ដែល GA ប្រមូលផ្តុំ។ ស្របជាមួយនឹងការកើនឡើងនៃកម្រិត GA, SAM នៃ quintuple ga2ox mutant inflorescence មានទំហំធំជាង Col-0 (រូបភាពបន្ថែម 12a, b) ហើយបើប្រៀបធៀបទៅនឹង Col-0 នោះ quintuple ga2ox SAM បានបង្ហាញពីការចែកចាយខុសគ្នាយ៉ាងច្បាស់នៃមុំបែងចែកកោសិកា ជាមួយនឹងការកើនឡើងនូវមុំ 50° ម្តងទៀត។ ការបែងចែកតង់សង់ (រូបភាពបន្ថែម 12a–c) ។ ដូច្នេះ យើងបង្ហាញថាការធ្វើឱ្យសកម្មនៃសញ្ញា GA និងការប្រមូលផ្តុំ GA បណ្តាលឱ្យមានការបែងចែកកោសិកានៅពេលក្រោយនៅក្នុង IPR និង SAM ដែលនៅសល់។
a, b ការមើលឃើញ 3D នៃស្រទាប់ L1 នៃ PI-stained Ler (a) និង global della mutant (b) SAM ដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍ confocal ។ ជញ្ជាំងកោសិកាថ្មីដែលបានបង្កើតឡើងនៅក្នុង SAM (ប៉ុន្តែមិនមែនជាបឋម) ក្នុងរយៈពេល 10 ម៉ោងត្រូវបានបង្ហាញ និងពណ៌ទៅតាមតម្លៃមុំរបស់វា។ ធាតុបញ្ចូលបង្ហាញ SAM នៅ 0 ម៉ោង។ របារពណ៌ត្រូវបានបង្ហាញនៅជ្រុងខាងស្តាំខាងក្រោម។ សញ្ញាព្រួញក្នុង (b) ចង្អុលទៅឧទាហរណ៍នៃឯកសារក្រឡាដែលបានតម្រឹមនៅក្នុង della mutant សកល។ ការពិសោធន៍ត្រូវបានធ្វើម្តងទៀតពីរដងជាមួយនឹងលទ្ធផលស្រដៀងគ្នា។ ce ការប្រៀបធៀបនៃការបែងចែកប្រេកង់នៃការតំរង់ទិសយន្តហោះបែងចែកកោសិកានៅក្នុង SAM ទាំងមូល (d), IPR (e) និង non-IPR (f) រវាង Ler និង della សកល។ តម្លៃ P ត្រូវបានគេទទួលបានដោយប្រើការធ្វើតេស្ត Kolmogorov-Smirnov ដែលមានកន្ទុយពីរ។ f, g ការមើលឃើញរូបភាព 3D នៃរូបភាពប្រសព្វនៃ PI-stained SAM នៃ Col-0 (i) និង pCUC2::gai-1-VENUS (j) រុក្ខជាតិប្តូរហ្សែន។ បន្ទះ (a, b) បង្ហាញជញ្ជាំងកោសិកាថ្មី (ប៉ុន្តែមិនមែន primordia) ដែលបង្កើតឡើងនៅក្នុង SAM ក្នុងរយៈពេល 10 ម៉ោង។ ការពិសោធន៍ត្រូវបានធ្វើម្តងទៀតពីរដងជាមួយនឹងលទ្ធផលស្រដៀងគ្នា។ h–j ការប្រៀបធៀបនៃការបែងចែកប្រេកង់នៃទិសដៅនៃការបែងចែកកោសិកាដែលមានទីតាំងនៅ SAM (h), IPR (i) និងមិនមែន IPR (j) រវាង Col-0 និង pCUC2::gai-1-VENUS រុក្ខជាតិ។ តម្លៃ P ត្រូវបានគេទទួលបានដោយប្រើតេស្ត Kolmogorov-Smirnov ដែលមានកន្ទុយពីរ។
បន្ទាប់ យើងបានសាកល្បងប្រសិទ្ធភាពនៃការរារាំងសញ្ញា GA ជាពិសេសនៅក្នុង IPR ។ ដល់ទីបញ្ចប់នេះ យើងបានប្រើឧបករណ៍ផ្សព្វផ្សាយ cotyledon cup 2 (CUC2) ដើម្បីជំរុញការបញ្ចេញមតិនៃប្រូតេអ៊ីន gai-1 អវិជ្ជមានលេចធ្លោដែលត្រូវបានបញ្ចូលគ្នាទៅនឹង VENUS (នៅក្នុងបន្ទាត់ pCUC2::gai-1-VENUS) ។ នៅក្នុង SAM ប្រភេទព្រៃ អ្នកផ្សព្វផ្សាយ CUC2 ជំរុញការបញ្ចេញមតិនៃ IPR ភាគច្រើននៅក្នុង SAM រួមទាំងកោសិកាព្រំដែនចាប់ពី P4 តទៅ ហើយកន្សោមជាក់លាក់ស្រដៀងគ្នានេះត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅក្នុងរុក្ខជាតិ pCUC2::gai-1-VENUS (សូមមើលខាងក្រោម)។ ការចែកចាយមុំបែងចែកកោសិកានៅទូទាំង SAM ឬ IPR នៃ pCUC2:: រុក្ខជាតិ gai-1-VENUS មិនខុសគ្នាខ្លាំងពីប្រភេទព្រៃនោះទេ ទោះបីជាយើងបានរកឃើញដោយមិនបានរំពឹងទុកថាកោសិកាដែលមិនមាន IPR នៅក្នុងរុក្ខជាតិទាំងនេះបានបែងចែកនៅប្រេកង់ខ្ពស់ជាង 80-90° (រូបភាព 6f-j)។
វាត្រូវបានគេណែនាំថាទិសដៅនៃការបែងចែកកោសិកាអាស្រ័យលើធរណីមាត្រនៃ SAM ជាពិសេសភាពតានតឹង tensile ដែលបង្កើតដោយ curvature46 ជាលិកា។ ដូច្នេះ យើងបានសួរថាតើរូបរាងរបស់ SAM ត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុងរុក្ខជាតិ della global mutant និង pCUC2::gai-1-VENUS ដែរឬទេ។ ដូចដែលបានរាយការណ៍ពីមុន 12 ទំហំនៃ della global mutant SAM គឺធំជាងប្រភេទសត្វព្រៃ (រូបភាពបន្ថែម 13a, b, d)។ នៅក្នុងកន្លែងបង្កាត់ពូជនៃ CLV3 និង STM RNA បានបញ្ជាក់ពីការពង្រីក meristem នៅក្នុង della mutants និងបានបង្ហាញពីការពង្រីកនៅពេលក្រោយនៃកោសិកាដើម (រូបភាពបន្ថែម 13e, f, h, i) ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ កោង SAM គឺស្រដៀងគ្នានៅក្នុងហ្សែនទាំងពីរ (រូបភាពបន្ថែម 13k, m, n, p) ។ យើងបានសង្កេតឃើញការកើនឡើងស្រដៀងគ្នានៃទំហំនៅក្នុង gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant ដោយគ្មានការផ្លាស់ប្តូរកោងបើប្រៀបធៀបទៅនឹងប្រភេទព្រៃ (រូបភាពបន្ថែម 13c, d, g, j, l, o, p) ។ ភាពញឹកញាប់នៃការតំរង់ទិសការបែងចែកកោសិកាក៏ត្រូវបានប៉ះពាល់ផងដែរនៅក្នុង della quadruple mutant ប៉ុន្តែក្នុងកម្រិតតិចជាងនៅក្នុង della monolithic mutant (រូបភាពបន្ថែម 12d-f) ។ ប្រសិទ្ធភាពកិតើនេះ រួមជាមួយនឹងកង្វះនៃឥទ្ធិពលលើការកោង បង្ហាញថាសកម្មភាព RGL3 ដែលនៅសល់ក្នុង Della quadruple mutant កំណត់ការផ្លាស់ប្តូរការតំរង់ទិសការបែងចែកកោសិកាដែលបណ្តាលមកពីការបាត់បង់សកម្មភាព DELLA ហើយការផ្លាស់ប្តូរនៃការបែងចែកកោសិកានៅពេលក្រោយកើតឡើងក្នុងការឆ្លើយតបទៅនឹងការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុងសកម្មភាពផ្តល់សញ្ញា GA ជាជាងការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុងធរណីមាត្រ SAM ។ ដូចដែលបានពិពណ៌នាខាងលើ អ្នកផ្សព្វផ្សាយ CUC2 ជំរុញកន្សោម IPR នៅក្នុង SAM ចាប់ផ្តើមនៅ P4 (រូបភាពបន្ថែម 14a, b) ហើយផ្ទុយទៅវិញ pCUC2::gai-1-VENUS SAM មានទំហំកាត់បន្ថយ ប៉ុន្តែកោងខ្ពស់ជាង (រូបភាពបន្ថែម 14c–h)។ ការផ្លាស់ប្តូរនេះនៅក្នុង pCUC2::gai-1-VENUS SAM morphology អាចបណ្តាលឱ្យមានការចែកចាយខុសគ្នានៃភាពតានតឹងមេកានិកបើប្រៀបធៀបទៅនឹងប្រភេទព្រៃ ដែលភាពតានតឹងក្នុងរង្វង់ខ្ពស់ចាប់ផ្តើមនៅចម្ងាយខ្លីជាងពីមជ្ឈមណ្ឌល SAM47 ។ ម៉្យាងទៀតការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុង pCUC2::gai-1-VENUS SAM morphology អាចបណ្តាលមកពីការផ្លាស់ប្តូរលក្ខណៈសម្បត្តិមេកានិចក្នុងតំបន់ដែលបណ្តាលមកពីការបញ្ចេញហ្សែន 48 ។ ក្នុងករណីទាំងពីរនេះ វាអាចប៉ះប៉ូវផ្នែកខ្លះនៃផលប៉ះពាល់នៃការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុងសញ្ញា GA ដោយបង្កើនលទ្ធភាពដែលកោសិកានឹងបែងចែកក្នុងរង្វង់/ទិសឆ្លងកាត់ ដោយពន្យល់ពីការសង្កេតរបស់យើង។
សរុបមក ទិន្នន័យរបស់យើងបញ្ជាក់ថា សញ្ញា GA ខ្ពស់ជាងដើរតួនាទីយ៉ាងសកម្មក្នុងការតម្រង់ទិសក្រោយនៃយន្តហោះបែងចែកកោសិកានៅក្នុង IPR ។ ពួកគេក៏បង្ហាញផងដែរថា កោងនៃ meristem ក៏មានឥទ្ធិពលលើការតំរង់ទិសនៃយន្តហោះបែងចែកកោសិកានៅក្នុង IPR ផងដែរ។
ការតំរង់ទិសឆ្លងកាត់នៃយន្តហោះផ្នែកនៅក្នុង IPR ដោយសារតែសកម្មភាពសញ្ញា GA ខ្ពស់ បង្ហាញថា GA រៀបចំឯកសារកោសិការ៉ាឌីកាល់ជាមុននៅក្នុងអេពីដេមីក្នុង SAM ដើម្បីកំណត់អង្គការកោសិកាដែលនឹងត្រូវបានរកឃើញនៅពេលក្រោយនៅក្នុងផ្នែកខាងក្នុងនៃអេពីដេមី។ ជាការពិតណាស់ ឯកសារក្រឡាបែបនេះត្រូវបានគេមើលឃើញជាញឹកញាប់នៅក្នុងរូបភាព SAM នៃ della global mutants (រូបភាព 6b)។ ដូច្នេះ ដើម្បីស្វែងយល់បន្ថែមអំពីមុខងារអភិវឌ្ឍន៍នៃគំរូលំហនៃសញ្ញា GA នៅក្នុង SAM យើងបានប្រើការថតរូបភាពតាមពេលវេលា ដើម្បីវិភាគអង្គការលំហនៃកោសិកានៅក្នុង IPR ក្នុងប្រភេទសត្វព្រៃ (Ler និង Col-0), della global mutants និង pCUC2::gai-1-VENUS រុក្ខជាតិប្តូរហ្សែន។
យើងបានរកឃើញថា qmRGA បានបង្ហាញថាសកម្មភាពសញ្ញា GA នៅក្នុង IPR បានកើនឡើងពី P1/P2 ហើយឡើងដល់កំពូលនៅ P4 ហើយលំនាំនេះនៅតែថេរតាមពេលវេលា (រូបភាព 4a–f និងបន្ថែមរូបភាព 8c–f, k) ។ ដើម្បីវិភាគការរៀបចំលំហនៃកោសិកាក្នុង IPR ជាមួយនឹងការបង្កើនសញ្ញា GA យើងបានដាក់ស្លាកកោសិកា Ler IPR ខាងលើ និងផ្នែកនៃ P4 យោងទៅតាមជោគវាសនានៃការអភិវឌ្ឍន៍របស់ពួកគេដែលបានវិភាគ 34 ម៉ោងបន្ទាប់ពីការសង្កេតដំបូង ពោលគឺច្រើនជាង 2 ដង plastid ដែលអនុញ្ញាតឱ្យយើងធ្វើតាមកោសិកា IPR កំឡុងពេលការអភិវឌ្ឍន៍បឋមពី P1/P2 ដល់ P4 ។ យើងបានប្រើពណ៌បីផ្សេងគ្នា៖ ពណ៌លឿងសម្រាប់កោសិកាទាំងនោះដែលត្រូវបានដាក់បញ្ចូលទៅក្នុង primordium នៅជិត P4 ពណ៌បៃតងសម្រាប់អ្នកដែលមាននៅក្នុង IPR និងពណ៌ស្វាយសម្រាប់អ្នកដែលបានចូលរួមក្នុងដំណើរការទាំងពីរ (រូបភាព 7a–c)។ នៅ t0 (0 ម៉ោង) 1-2 ស្រទាប់នៃកោសិកា IPR អាចមើលឃើញនៅពីមុខ P4 (រូបភាព 7a) ។ ដូចដែលបានរំពឹងទុក នៅពេលដែលកោសិកាទាំងនេះបានបែងចែក ពួកវាបានធ្វើដូច្នេះជាចម្បងតាមរយៈយន្តហោះការបែងចែកឆ្លងកាត់ (រូបភាព 7a–c)។ លទ្ធផលស្រដៀងគ្នានេះត្រូវបានគេទទួលបានដោយប្រើ Col-0 SAM (ផ្តោតលើ P3 ដែលព្រំដែនរបស់វាបត់ស្រដៀងទៅនឹង P4 នៅក្នុង Ler) ទោះបីជានៅក្នុងប្រភេទនេះ ផ្នត់ដែលបានបង្កើតឡើងនៅព្រំដែនផ្កាបានលាក់កោសិកា IPR លឿនជាងមុន (រូបភាព 7g-i)។ ដូច្នេះ គំរូការបែងចែកនៃកោសិកា IPR រៀបចំកោសិកាជាមុនជាជួររ៉ាឌីកាល់ ដូចជានៅក្នុង internodes ។ ការរៀបចំជួររ៉ាឌីកាល់ និងការធ្វើមូលដ្ឋានីយកម្មនៃកោសិកា IPR រវាងសរីរាង្គបន្តបន្ទាប់គ្នា បង្ហាញថាកោសិកាទាំងនេះគឺជាអ្នកបន្តពូជខាងក្នុង។
នៅទីនេះ យើងបានបង្កើតឧបករណ៍ចាប់សញ្ញា GA ratiometric, qmRGA ដែលអនុញ្ញាតឱ្យធ្វើផែនទីបរិមាណនៃសកម្មភាពផ្តល់សញ្ញា GA ដែលបណ្តាលមកពីការប្រមូលផ្តុំ GA និង GA receptor រួមបញ្ចូលគ្នា ខណៈពេលដែលកាត់បន្ថយការជ្រៀតជ្រែកជាមួយផ្លូវសញ្ញា endogenous ដោយហេតុនេះផ្តល់នូវព័ត៌មានអំពីមុខងារ GA នៅកម្រិតកោសិកា។ ដល់ទីបញ្ចប់នេះ យើងបានសាងសង់ប្រូតេអ៊ីន DELLA ដែលបានកែប្រែ mRGA ដែលបាត់បង់សមត្ថភាពក្នុងការចងដៃគូអន្តរកម្ម DELLA ប៉ុន្តែនៅតែមានភាពរសើបចំពោះ proteolysis ដែលបណ្តាលមកពី GA ។ qmRGA ឆ្លើយតបទៅនឹងការផ្លាស់ប្តូរទាំង exogenous និង endogenous នៅក្នុងកម្រិត GA ហើយលក្ខណៈសម្បត្តិនៃការចាប់សញ្ញាថាមវន្តរបស់វាអនុញ្ញាតឱ្យមានការវាយតម្លៃនៃការផ្លាស់ប្តូរ spatiotemporal នៅក្នុងសកម្មភាពផ្តល់សញ្ញា GA កំឡុងពេលអភិវឌ្ឍ។ qmRGA ក៏ជាឧបករណ៍ដែលអាចបត់បែនបានផងដែរព្រោះវាអាចសម្របទៅនឹងជាលិកាផ្សេងៗដោយការផ្លាស់ប្តូរអ្នកផ្សព្វផ្សាយដែលប្រើសម្រាប់ការបញ្ចេញមតិរបស់វា (បើចាំបាច់) ហើយបានផ្តល់លក្ខណៈអភិរក្សនៃផ្លូវសញ្ញា GA និងគំនូរ PFYRE ឆ្លងកាត់ angiosperms វាទំនងជាអាចផ្ទេរទៅប្រភេទផ្សេងទៀត 22 ។ ស្របជាមួយនេះ ការផ្លាស់ប្តូរសមមូលនៅក្នុងអង្ករ SLR1 DELLA ប្រូតេអ៊ីន (HYY497AAA) ក៏ត្រូវបានបង្ហាញដើម្បីទប់ស្កាត់សកម្មភាពបង្រ្កាបកំណើននៃ SLR1 ខណៈពេលដែលកាត់បន្ថយការរិចរិលដែលសម្របសម្រួល GA របស់វាបន្តិចបន្តួច ដែលស្រដៀងទៅនឹង mRGA23 ។ គួរកត់សម្គាល់ថាការសិក្សាថ្មីៗនៅក្នុង Arabidopsis បានបង្ហាញថាការផ្លាស់ប្តូរអាស៊ីតអាមីណូតែមួយនៅក្នុងដែន PFYRE (S474L) បានផ្លាស់ប្តូរសកម្មភាពប្រតិចារិកនៃ RGA ដោយមិនប៉ះពាល់ដល់សមត្ថភាពក្នុងការធ្វើអន្តរកម្មជាមួយដៃគូកត្តាចម្លង 50 ។ ទោះបីជាការផ្លាស់ប្តូរនេះមានភាពជិតស្និទ្ធទៅនឹងការជំនួសអាស៊ីតអាមីណូចំនួន 3 ដែលមាននៅក្នុង mRGA ក៏ដោយ ការសិក្សារបស់យើងបង្ហាញថាការផ្លាស់ប្តូរទាំងពីរនេះផ្លាស់ប្តូរលក្ខណៈខុសគ្នានៃ DELLA ។ ទោះបីជាដៃគូកត្តាចម្លងភាគច្រើនភ្ជាប់ទៅនឹងដែន LHR1 និង SAW នៃ DELLA26,51 ក៏ដោយ ក៏អាស៊ីតអាមីណូដែលបានរក្សាទុកមួយចំនួននៅក្នុងដែន PFYRE អាចជួយធ្វើឱ្យអន្តរកម្មទាំងនេះមានស្ថេរភាព។
ការអភិវឌ្ឍន៍ Internode គឺជាលក្ខណៈសំខាន់នៅក្នុងស្ថាបត្យកម្មរុក្ខជាតិ និងការកែលម្អទិន្នផល។ qmRGA បង្ហាញសកម្មភាពសញ្ញា GA ខ្ពស់ជាងនៅក្នុងកោសិកា progenitor IPR internode ។ តាមរយៈការរួមបញ្ចូលគ្នានៃរូបភាពបរិមាណ និងពន្ធុវិទ្យា យើងបានបង្ហាញថា គំរូសញ្ញា GA ត្រួតលើផែនការបែងចែកកោសិការាងជារង្វង់/ឆ្លងកាត់នៅក្នុង SAM epidermis ដោយបង្កើតទម្រង់នៃអង្គការការបែងចែកកោសិកាដែលត្រូវការសម្រាប់ការអភិវឌ្ឍផ្នែកខាងក្នុង។ និយតករជាច្រើននៃការតំរង់ទិសយន្តហោះនៃការបែងចែកកោសិកាត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណក្នុងអំឡុងពេលនៃការអភិវឌ្ឍន៍52,53។ ការងាររបស់យើងផ្តល់នូវឧទាហរណ៍ច្បាស់លាស់អំពីរបៀបដែលសកម្មភាពផ្តល់សញ្ញា GA គ្រប់គ្រងប៉ារ៉ាម៉ែត្រកោសិកានេះ។ DELLA អាចធ្វើអន្តរកម្មជាមួយ prefolding protein complexes41 ដូច្នេះសញ្ញា GA អាចគ្រប់គ្រងការតំរង់ទិសនៃការបែងចែកកោសិកាដោយមានឥទ្ធិពលផ្ទាល់ទៅលើការតំរង់ទិស microtubule cortical 40,41,54,55។ យើងបានបង្ហាញដោយមិននឹកស្មានដល់ថានៅក្នុង SAM ទំនាក់ទំនងនៃសកម្មភាពសញ្ញា GA ខ្ពស់ជាងនេះមិនមែនជាការពន្លូតកោសិកា ឬការបែងចែកទេ ប៉ុន្តែមានតែការរីកលូតលាស់ anisotropy ដែលស្របជាមួយនឹងឥទ្ធិពលផ្ទាល់របស់ GA លើទិសដៅនៃការបែងចែកកោសិកានៅក្នុង IPR ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ យើងមិនអាចបដិសេធថាឥទ្ធិពលនេះក៏អាចជាប្រយោលផងដែរ ឧទាហរណ៍ សម្របសម្រួលដោយ GA-induced cell wall softening56។ ការផ្លាស់ប្តូរលក្ខណៈសម្បត្តិនៃជញ្ជាំងកោសិកាបង្កឱ្យមានភាពតានតឹងផ្នែកមេកានិច57,58 ដែលអាចមានឥទ្ធិពលលើការតំរង់ទិសនៃយន្តហោះការបែងចែកកោសិកាដោយប៉ះពាល់ដល់ការតំរង់ទិសនៃ microtubules cortical39,46,59។ ឥទ្ធិពលរួមបញ្ចូលគ្នានៃភាពតានតឹងមេកានិចដែលបណ្ដាលមកពី GA និងបទប្បញ្ញត្តិផ្ទាល់នៃការតំរង់ទិស microtubule ដោយ GA អាចត្រូវបានចូលរួមនៅក្នុងការបង្កើតគំរូជាក់លាក់នៃការតំរង់ទិសការបែងចែកកោសិកានៅក្នុង IPR ដើម្បីកំណត់ internodes ហើយការសិក្សាបន្ថែមទៀតគឺចាំបាច់ដើម្បីសាកល្បងគំនិតនេះ។ ស្រដៀងគ្នានេះដែរ ការសិក្សាពីមុនបានលើកឡើងពីសារៈសំខាន់នៃ DELLA-interacting proteins TCP14 និង 15 ក្នុងការគ្រប់គ្រងនៃការបង្កើត internode 60,61 ហើយកត្តាទាំងនេះអាចសម្របសម្រួលសកម្មភាពរបស់ GA រួមជាមួយ BREVIPEDICELLUS (BP) និង PENNYWISE (PNY) ដែលគ្រប់គ្រងការអភិវឌ្ឍន៍ internode និងត្រូវបានបង្ហាញថាមានឥទ្ធិពល 2 សញ្ញា GA ។ ដោយសារ DELLAs មានអន្តរកម្មជាមួយ brassinosteroid អេទីឡែន អាស៊ីត jasmonic និងអាស៊ីត abscisic (ABA) ផ្លូវ63,64 ហើយអរម៉ូនទាំងនេះអាចមានឥទ្ធិពលលើ microtubule orientation65 ឥទ្ធិពលនៃ GA លើការតំរង់ទិសការបែងចែកកោសិកាក៏អាចត្រូវបានសម្របសម្រួលដោយអរម៉ូនផ្សេងទៀតផងដែរ។
ការសិក្សា cytological ដំបូងបានបង្ហាញថាទាំងតំបន់ខាងក្នុងនិងខាងក្រៅនៃ Arabidopsis SAM គឺត្រូវបានទាមទារសម្រាប់ការអភិវឌ្ឍ internode2,42 ។ ការពិតដែលថា GA គ្រប់គ្រងការបែងចែកកោសិកាយ៉ាងសកម្មនៅក្នុងជាលិកាខាងក្នុង 12 គាំទ្រមុខងារពីរនៃ GA ក្នុងការគ្រប់គ្រងទំហំ meristem និង internode នៅក្នុង SAM ។ គំរូនៃការបែងចែកកោសិកាទិសដៅក៏ត្រូវបានគ្រប់គ្រងយ៉ាងតឹងរ៉ឹងនៅក្នុងជាលិកា SAM ខាងក្នុង ហើយបទប្បញ្ញត្តិនេះគឺចាំបាច់សម្រាប់ការលូតលាស់ដើម52។ វានឹងគួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ក្នុងការពិនិត្យមើលថាតើ GA ក៏ដើរតួក្នុងការតំរង់ទិសយន្តហោះការបែងចែកកោសិកានៅក្នុងអង្គការ SAM ខាងក្នុង ដោយហេតុនេះធ្វើសមកាលកម្មការបញ្ជាក់ និងការអភិវឌ្ឍន៍នៃ internodes នៅក្នុង SAM ។
រុក្ខជាតិត្រូវបានដាំដុះនៅក្នុង vitro នៅក្នុងដី ឬ 1x Murashige-Skoog (MS) មធ្យម (Duchefa) បន្ថែមដោយ 1% sucrose និង 1% agar (Sigma) ក្រោមលក្ខខណ្ឌស្តង់ដារ (ពន្លឺ 16 ម៉ោង, 22 ° C) លើកលែងតែការពិសោធន៍ hypocotyl និងឫសគល់ ដែលសំណាបត្រូវបានដាំដុះនៅលើចានបញ្ឈរក្រោមពន្លឺថេរ និង 22°C ។ សម្រាប់ការពិសោធន៍នីត្រាត រុក្ខជាតិត្រូវបានដាំដុះនៅលើឧបករណ៍ផ្ទុក MS ដែលបានកែប្រែ (ឧបករណ៍ផ្ទុករុក្ខជាតិ bioWORLD) បន្ថែមដោយនីត្រាតគ្រប់គ្រាន់ (0 ឬ 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinate, 1% sucrose និង 1% A-agar (Sigma) ក្រោមលក្ខខណ្ឌរយៈពេលវែង។
GID1a cDNA បញ្ចូលទៅក្នុង pDONR221 ត្រូវបានផ្សំជាមួយ pDONR P4-P1R-pUBQ10 និង pDONR P2R-P3-mCherry ទៅក្នុង pB7m34GW ដើម្បីបង្កើត pUBQ10::GID1a-mCherry ។ IDD2 DNA ដែលបានបញ្ចូលទៅក្នុង pDONR221 ត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុង pB7RWG266 ដើម្បីបង្កើត p35S:IDD2-RFP ។ ដើម្បីបង្កើត pGID1b::2xmTQ2-GID1b បំណែក 3.9 kb ខាងលើនៃតំបន់សរសេរកូដ GID1b និងបំណែក 4.7 kb ដែលមាន GID1b cDNA (1.3 kb) និង terminator (3.4 kb) ត្រូវបានពង្រីកជាលើកដំបូងដោយប្រើ p.R.O.P ដែលបន្ទាប់មកបញ្ចូលទៅក្នុង Supplement ។ P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) និង pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) រៀងគ្នា ហើយទីបំផុតត្រូវបានផ្សំឡើងវិញជាមួយ pDONR221 2xmTQ268 ទៅក្នុងវ៉ិចទ័រគោលដៅ pGreen 012567 ដោយប្រើការក្លូន Gateway ។ ដើម្បីបង្កើត pCUC2::LSSmOrange លំដាប់ផ្សព្វផ្សាយ CUC2 (3229 bp ខាងលើនៃ ATG) បន្តដោយលំដាប់កូដនៃ Stokes-shifted mOrange (LSSmOrange)69 ជាមួយនឹងសញ្ញាមូលដ្ឋាននីយកម្មនុយក្លេអ៊ែរ N7 និង NOS transcriptional terminator ត្រូវបានផ្គុំចូលទៅក្នុងវ៉ិចទ័រ pGreen-franmentate kanyam ប្រព័ន្ធផ្សំឡើងវិញ (Invitrogen) ។ វ៉ិចទ័រគោលពីររបស់រុក្ខជាតិត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុង Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 ហើយបញ្ចូលទៅក្នុងស្លឹក Nicotiana benthamiana ដោយវិធីជ្រៀតចូល Agrobacterium និងចូលទៅក្នុង Arabidopsis thaliana Col-0 ដោយវិធីជ្រលក់ផ្ការៀងៗខ្លួន។ pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry និង pCLV3::mCherry-NLS qmRGA ត្រូវបានដាច់ឆ្ងាយពី F3 និង F1 progenies នៃឈើឆ្កាងរៀងៗខ្លួន។
ការបង្កាត់ RNA នៅក្នុង situ ត្រូវបានអនុវត្តនៅលើពន្លកប្រវែងប្រហែល 1 សង់ទីម៉ែត្រ 72 ដែលត្រូវបានប្រមូលនិងជួសជុលភ្លាមៗនៅក្នុងដំណោះស្រាយ FAA (3.7% formaldehyde, 5% acetic acid, 50% ethanol) មុនត្រជាក់ដល់ 4 ° C ។ បន្ទាប់ពីការព្យាបាលដោយបូមធូលី 2 × 15 នាទី ឧបករណ៍ជួសជុលត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរ ហើយសំណាកត្រូវបាន incubated ពេញមួយយប់។ GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, និង RGL3 cDNAs និងការស៊ើបអង្កេត antisense ទៅ 3′-UTRs របស់ពួកគេត្រូវបានសំយោគដោយប្រើ primers ដែលបង្ហាញក្នុងតារាងបន្ថែម 3 ដូចដែលបានពិពណ៌នាដោយ Rosier et al.73 ។ ការស៊ើបអង្កេតដែលមានស្លាក Digoxigenin ត្រូវបានគេរកឃើញថាមានភាពស៊ាំដោយប្រើប្រាស់អង្គបដិប្រាណ digoxigenin (ការរំលាយ 3000 ដង; Roche លេខកាតាឡុក៖ 11 093 274 910) ហើយផ្នែកជាច្រើនត្រូវបានប្រឡាក់ដោយសារធាតុ 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP-2, 2000-2000) ។ (NBT, ដំណោះស្រាយ 200 ដង) ។
ពេលវេលាផ្សាយ៖ ខែកុម្ភៈ-១០-២០២៥