សូមអរគុណសម្រាប់ការទស្សនា Nature.com ។កំណែរបស់កម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតដែលអ្នកកំពុងប្រើមានកម្រិតគាំទ្រ CSS ។ដើម្បីទទួលបានលទ្ធផលល្អបំផុត យើងសូមណែនាំឱ្យអ្នកប្រើកំណែថ្មីនៃកម្មវិធីរុករកតាមអ៊ីនធឺណិតរបស់អ្នក (ឬបិទមុខងារភាពឆបគ្នានៅក្នុង Internet Explorer)។ក្នុងពេលនេះ ដើម្បីធានាបាននូវការគាំទ្រជាបន្ត យើងកំពុងបង្ហាញគេហទំព័រដោយមិនប្រើរចនាប័ទ្ម ឬ JavaScript។
របកគំហើញ និងការប្រើប្រាស់ប្រកបដោយអត្ថប្រយោជន៍នៃផលិតផលធម្មជាតិអាចជួយកែលម្អជីវិតមនុស្ស។សារធាតុគីមីរារាំងការលូតលាស់របស់រុក្ខជាតិត្រូវបានប្រើប្រាស់យ៉ាងទូលំទូលាយជាថ្នាំសំលាប់ស្មៅដើម្បីកំចាត់ស្មៅ។ដោយសារតម្រូវការប្រើប្រាស់ប្រភេទថ្នាំសំលាប់ស្មៅផ្សេងៗគ្នា ចាំបាច់ត្រូវកំណត់អត្តសញ្ញាណសមាសធាតុជាមួយនឹងយន្តការថ្មីនៃសកម្មភាព។នៅក្នុងការសិក្សានេះ យើងបានរកឃើញសមាសធាតុប្រលោមលោក N -alkoxypyrrole, coumamonamide, ពី Streptomyces werraensis MK493-CF1 និងបានបង្កើតដំណើរការសំយោគពេញលេញ។តាមរយៈការវិភាគសកម្មភាពជីវសាស្រ្ត យើងបានរកឃើញថាអាស៊ីត urs-monoamic គឺជាអន្តរការីសំយោគនៃ urs-monoamide និងសក្តានុពលមួយ។ថ្នាំទប់ស្កាត់ការលូតលាស់របស់រុក្ខជាតិ.លើសពីនេះទៀត យើងបានបង្កើតនិស្សន្ទវត្ថុអាស៊ីត urbenonic ជាច្រើន រួមទាំងដេរីវេនៃ urbenyloxy (UDA) ដែលមានសកម្មភាពសម្លាប់ស្មៅខ្ពស់ ដោយមិនប៉ះពាល់អវិជ្ជមានដល់ការលូតលាស់នៃកោសិកា HeLa ។យើងក៏បានរកឃើញថាដេរីវេនៃអាស៊ីត urmotonic រំខានដល់ microtubules រុក្ខជាតិ។លើសពីនេះទៀត KAND ប៉ះពាល់ដល់សរសៃ actin និងបណ្តាលឱ្យស្លាប់កោសិកា។ឥទ្ធិពលចម្រុះទាំងនេះខុសពីថ្នាំទប់ស្កាត់ microtubule ដែលគេស្គាល់ ហើយស្នើយន្តការថ្មីនៃសកម្មភាពសម្រាប់អាស៊ីត ursonic ដែលតំណាងឱ្យអត្ថប្រយោជន៍ដ៏សំខាន់ក្នុងការអភិវឌ្ឍថ្នាំសំលាប់ស្មៅថ្មី។
របកគំហើញ និងការអនុវត្តជាក់ស្តែងនៃផលិតផលធម្មជាតិដែលមានប្រយោជន៍ និងនិស្សន្ទវត្ថុរបស់ពួកគេ គឺជាមធ្យោបាយនៃការកែលម្អគុណភាពនៃជីវិតរបស់មនុស្ស។សារធាតុមេតាបូលីតបន្ទាប់បន្សំដែលផលិតដោយអតិសុខុមប្រាណ រុក្ខជាតិ និងសត្វល្អិតបាននាំឱ្យមានការរីកចំរើនយ៉ាងសំខាន់ក្នុងវិស័យវេជ្ជសាស្ត្រ និងកសិកម្ម។ថ្នាំអង់ទីប៊ីយោទិច និងថ្នាំប្រឆាំងជំងឺមហារីកឈាមជាច្រើនត្រូវបានបង្កើតឡើងពីផលិតផលធម្មជាតិ។លើសពីនេះទៀតប្រភេទផ្សេងៗនៃថ្នាំសំលាប់សត្វល្អិតថ្នាំសម្លាប់ផ្សិត និងថ្នាំសំលាប់ស្មៅត្រូវបានចម្រាញ់ចេញពីផលិតផលធម្មជាតិទាំងនេះសម្រាប់ប្រើប្រាស់ក្នុងវិស័យកសិកម្ម។ជាពិសេស ថ្នាំសំលាប់ស្មៅកំចាត់ស្មៅគឺជាឧបករណ៍សំខាន់សម្រាប់បង្កើនទិន្នផលដំណាំក្នុងកសិកម្មទំនើប ហើយប្រភេទផ្សេងៗនៃសមាសធាតុត្រូវបានប្រើប្រាស់ក្នុងពាណិជ្ជកម្មរួចហើយ។ដំណើរការកោសិកាជាច្រើននៅក្នុងរុក្ខជាតិ ដូចជាការសំយោគរស្មីសំយោគ ការរំលាយអាហារអាស៊ីតអាមីណូ ការសំយោគជញ្ជាំងកោសិកា បទបញ្ជានៃ mitosis សញ្ញា phytohormone ឬការសំយោគប្រូតេអ៊ីនត្រូវបានចាត់ទុកថាជាគោលដៅធម្មតានៃថ្នាំសំលាប់ស្មៅ។សមាសធាតុដែលរារាំងមុខងារ microtubule គឺជាប្រភេទថ្នាំសំលាប់ស្មៅទូទៅដែលប៉ះពាល់ដល់ការលូតលាស់របស់រុក្ខជាតិដោយប៉ះពាល់ដល់បទប្បញ្ញត្តិ mitotic 2.
Microtubules គឺជាសមាសធាតុនៃ cytoskeleton ហើយត្រូវបានអភិរក្សយ៉ាងទូលំទូលាយនៅក្នុងកោសិកា eukaryotic ។tubulin heterodimer មាន α-tubulin និង β-tubulin បង្កើតជា microtubule protofilaments លីនេអ៊ែរ ជាមួយនឹង protofilaments 13 បង្កើតជារចនាសម្ព័ន្ធស៊ីឡាំង។Microtubules ដើរតួនាទីជាច្រើននៅក្នុងកោសិការុក្ខជាតិ រួមទាំងការកំណត់រូបរាងកោសិកា ការបែងចែកកោសិកា និងការដឹកជញ្ជូនខាងក្នុងកោសិកា3,4។កោសិការុក្ខជាតិមាន microtubules នៅក្រោមភ្នាសប្លាស្មា interphase ហើយអ្វីដែលគេហៅថា cortical microtubules ត្រូវបានគេគិតថាដើម្បីគ្រប់គ្រងការរៀបចំនៃ cellulose microfibrils តាមរយៈបទប្បញ្ញត្តិនៃ cellulose synthase complexes4,5 ។កោសិកា Cortical microtubules នៃកោសិកា epidermal ជា root ដែលមានវត្តមាននៅក្នុងតំបន់នៃការពន្លូតយ៉ាងលឿននៃចុងឫស មានទីតាំងនៅខាងក្រោយ ហើយមីក្រូហ្វាយ cellulose ដើរតាម microtubules ទាំងនេះ និងកំណត់ទិសដៅនៃការពង្រីកកោសិកា ដោយហេតុនេះជំរុញឱ្យមានការពន្លូតកោសិកា anisotropic ។ដូច្នេះមុខងារ microtubule គឺទាក់ទងយ៉ាងជិតស្និទ្ធទៅនឹង morphology រុក្ខជាតិ។ការជំនួសអាស៊ីតអាមីណូនៅក្នុងហ្សែនដែលអ៊ិនកូដ tubulin បណ្តាលឱ្យមានការយល់ច្រឡំនៃអារេ microtubule cortical និងការរីកលូតលាស់ផ្នែកខាងឆ្វេងឬខាងស្តាំនៅក្នុង Arabidopsis 6,7 ។ស្រដៀងគ្នានេះដែរ ការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុងប្រូតេអ៊ីនដែលទាក់ទងនឹង microtubule ដែលគ្រប់គ្រងសក្ដានុពលនៃ microtubule ក៏អាចនាំឱ្យមានការបង្ខូចទ្រង់ទ្រាយនៃការលូតលាស់ឫស 8,9,10,11,12,13។លើសពីនេះទៀត ការព្យាបាលដោយថ្នាំសំលាប់ស្មៅដែលរំខានដល់ microtubule ដូចជា disopyramide ដែលត្រូវបានគេស្គាល់ថា pretilachlor ក៏បណ្តាលឱ្យមានការលូតលាស់ឫស oblique ផ្នែកខាងឆ្វេង 14 ។ទិន្នន័យទាំងនេះបង្ហាញថាបទប្បញ្ញត្តិច្បាស់លាស់នៃមុខងារ microtubule គឺមានសារៈសំខាន់សម្រាប់កំណត់ទិសដៅនៃការលូតលាស់របស់រុក្ខជាតិ។
ប្រភេទផ្សេងៗនៃ microtubule inhibitors ត្រូវបានគេរកឃើញ ហើយថ្នាំទាំងនេះបានរួមចំណែកយ៉ាងសំខាន់ក្នុងការស្រាវជ្រាវ cytoskeletal ក៏ដូចជាកសិកម្ម និងឱសថ2.ជាពិសេស oryzalin សមាសធាតុ dinitroaniline disopyramide សមាសធាតុដែលទាក់ទងនឹង benzamide និងអាណាឡូករបស់វាអាចរារាំងមុខងារ microtubule ហើយដោយហេតុនេះរារាំងការលូតលាស់របស់រុក្ខជាតិ។ដូច្នេះ គេត្រូវបានគេប្រើយ៉ាងទូលំទូលាយជាថ្នាំសម្លាប់ស្មៅ។ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយ ដោយសារ microtubules គឺជាសមាសធាតុសំខាន់នៃកោសិការុក្ខជាតិ និងសត្វ សារធាតុរារាំង microtubule ភាគច្រើនគឺ cytotoxic ចំពោះប្រភេទកោសិកាទាំងពីរ។ដូច្នេះហើយ ទោះបីជាឧបករណ៍ប្រើប្រាស់ដែលគេទទួលស្គាល់ថាជាថ្នាំសម្លាប់ស្មៅក៏ដោយ ភ្នាក់ងារ antimicrotubule មានកំណត់ត្រូវបានប្រើប្រាស់សម្រាប់គោលបំណងជាក់ស្តែង។
Streptomyces គឺជាប្រភេទមួយនៃគ្រួសារ Streptomyces ដែលរួមមានបាក់តេរី aerobic, gram-positive, filamentous bacteria និងត្រូវបានគេស្គាល់យ៉ាងទូលំទូលាយសម្រាប់សមត្ថភាពរបស់វាក្នុងការផលិតនូវជួរដ៏ធំទូលាយនៃមេតាបូលីតបន្ទាប់បន្សំ។ដូច្នេះវាត្រូវបានគេចាត់ទុកថាជាប្រភពដ៏សំខាន់បំផុតនៃផលិតផលធម្មជាតិសកម្មជីវសាស្រ្តថ្មី។នៅក្នុងការសិក្សាបច្ចុប្បន្ន យើងបានរកឃើញសមាសធាតុថ្មីមួយហៅថា coumamonamide ដែលដាច់ដោយឡែកពី Streptomyces werraensis MK493-CF1 និង S. werraensis ISP 5486។ ដោយប្រើការវិភាគវិសាលគម និងការវិភាគពេញលេញ រចនាសម្ព័ន្ធនៃ coumamonamide ត្រូវបានកំណត់លក្ខណៈ និងគ្រោងឆ្អឹង N-alkoxypyrrole តែមួយគត់របស់វា។ ត្រូវបានកំណត់។ការសំយោគ។អាស៊ីត Ursmonic ដែលជាកម្រិតមធ្យមសំយោគនៃ ursmonoamide និងនិស្សន្ទវត្ថុរបស់វា ត្រូវបានរកឃើញថារារាំងការលូតលាស់ និងដំណុះនៃរុក្ខជាតិគំរូដ៏ពេញនិយម Arabidopsis thaliana។នៅក្នុងការសិក្សាទំនាក់ទំនងរចនាសម្ព័ន្ធ-សកម្មភាព យើងបានរកឃើញថា សមាសធាតុជាមួយ C9 ដែលត្រូវបានកែប្រែទៅជាអាស៊ីត ursonic ដែលហៅថា nonyloxy ដេរីវេនៃអាស៊ីត ursonic (KAND) យ៉ាងសំខាន់បង្កើនឥទ្ធិពលរារាំងដល់ការលូតលាស់ និងដំណុះ។គួរកត់សំគាល់ថា ថ្នាំទប់ស្កាត់ការលូតលាស់របស់រុក្ខជាតិដែលទើបរកឃើញថ្មីក៏ប៉ះពាល់ដល់ការលូតលាស់របស់ថ្នាំជក់ និងក្រលៀនផងដែរ ហើយមិនមានសារធាតុ cytotoxic ដល់បាក់តេរី ឬកោសិកា HeLa នោះទេ។លើសពីនេះទៅទៀត និស្សន្ទវត្ថុអាស៊ីត urmotonic មួយចំនួនបង្កឱ្យមាន phenotype ឫសដែលខូចទ្រង់ទ្រាយ ដែលបញ្ជាក់ថា និស្សន្ទវត្ថុទាំងនេះប៉ះពាល់ដល់ microtubules ដោយផ្ទាល់ ឬដោយប្រយោល។ដោយអនុលោមតាមគំនិតនេះ ការសង្កេតរបស់យើងអំពី microtubules ដែលមានស្លាក immunohistochemically ឬជាមួយនឹងប្រូតេអ៊ីន fluorescent បង្ហាញថាការព្យាបាល KAND depolymerizes microtubules ។លើសពីនេះ ការព្យាបាលជាមួយនិស្សន្ទវត្ថុអាស៊ីត kumamotonic បានរំខានដល់ microfilaments actin ។ដូច្នេះហើយ យើងបានរកឃើញថ្នាំទប់ស្កាត់ការលូតលាស់របស់រុក្ខជាតិថ្មីមួយ ដែលយន្តការសកម្មភាពពិសេសពាក់ព័ន្ធនឹងការបំផ្លិចបំផ្លាញនៃ cytoskeleton ។
ខ្សែ MK493-CF1 ដាច់ឆ្ងាយពីដីនៅ Shinagawa-ku ទីក្រុងតូក្យូ។សំពាធ MK493-CF1 បង្កើតបានជា stromal mycelium ដែលមានសាខាល្អ។លំដាប់ផ្នែកនៃហ្សែន 16S ribosomal RNA (1422 bp) ត្រូវបានកំណត់។សំពាធនេះគឺស្រដៀងទៅនឹង S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: ធម្មតាសំពាធ, 99.93%) ។ដោយផ្អែកលើលទ្ធផលនេះ វាត្រូវបានគេកំណត់ថាសំពាធនេះមានទំនាក់ទំនងយ៉ាងជិតស្និទ្ធទៅនឹងប្រភេទ S. werraensis ។ដូច្នេះ យើងដាក់ឈ្មោះជាបណ្ដោះអាសន្ននេះថា S. werraensis MK493-CF1។S. werraensis ISP 5486T ក៏ផលិតសមាសធាតុជីវសកម្មដូចគ្នាដែរ។ដោយសារមានការស្រាវជ្រាវដំបូងតិចតួចក្នុងការទទួលបានផលិតផលធម្មជាតិពីអតិសុខុមប្រាណនេះ ការស្រាវជ្រាវគីមីបន្ថែមទៀតត្រូវបានអនុវត្ត។បន្ទាប់ពីការដាំដុះ S. werraensis MK493-CF1 នៅលើឧបករណ៍ផ្ទុក barley ដោយការ fermentation សភាពរឹងនៅសីតុណ្ហភាព 30°C រយៈពេល 14 ថ្ងៃ ឧបករណ៍ផ្ទុកត្រូវបានស្រង់ចេញជាមួយនឹង 50% EtOH ។60 មីលីលីត្រនៃសំណាកត្រូវបានស្ងួតដើម្បីទទួលបាន 59.5 មីលីក្រាមនៃសារធាតុចម្រាញ់ឆៅ។ការដកស្រង់ប្រេងឆៅត្រូវបានទទួលរងនូវដំណាក់កាលបញ្ច្រាស HPLC ដើម្បីផ្តល់ឱ្យ N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1 ដែលមានឈ្មោះថា coumamonamide, 36.0 mg) ។បរិមាណសរុបនៃ 1 គឺប្រហែល 60% នៃការដកស្រង់ប្រេងឆៅ។ដូច្នេះហើយ ទើបយើងសម្រេចចិត្តសិក្សាលម្អិតអំពីលក្ខណៈសម្បត្តិរបស់ kumamotoamide ១.
Coumamonamide 1 គឺជាម្សៅ amorphous ពណ៌ស និងគុណភាពខ្ពស់ spectrometry (HRESIMS) បញ្ជាក់ C6H8N2O2 (រូបភាព 1) ។បំណែក pyrrole ជំនួស C2 នៃសមាសធាតុនេះត្រូវបានកំណត់លក្ខណៈដោយ δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH ក្នុងវិសាលគម 1H NMR: 4.5 Hz , H-5) និង δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) និងវិសាលគម 13C NMR បង្ហាញពីវត្តមានរបស់អាតូមកាបូន sp2 ចំនួនបួន។វត្តមានរបស់ក្រុមអាមីដនៅទីតាំង C2 ត្រូវបានវាយតម្លៃដោយការជាប់ទាក់ទងរបស់ HMBC ពីប្រូតុង C-3 ទៅនឹងកាបូនឌីអុកស៊ីត amide នៅ δC 161.1 ។លើសពីនេះទៀត 1 H និង 13 C NMR ឡើងដល់កំពូលនៅ δH 4.10 (3H, S) និង δC 68.3 បង្ហាញពីវត្តមានរបស់ក្រុម N-methoxy នៅក្នុងម៉ូលេគុល។ទោះបីជាទីតាំងត្រឹមត្រូវនៃក្រុម methoxy មិនទាន់ត្រូវបានកំណត់ដោយប្រើការវិភាគ spectroscopic ដូចជាការបង្កើនភាពខុសគ្នា spectroscopy និងអក្សរកាត់នុយក្លេអ៊ែរ Overhauser (NOEDF) ក៏ដោយ N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide បានក្លាយជាសមាសធាតុបេក្ខជនដំបូង។
ដើម្បីកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធត្រឹមត្រូវនៃ 1 ការសំយោគសរុបត្រូវបានអនុវត្ត (រូបភាព 2a) ។ការព្យាបាល 2-aminopyridine 2 ដែលមានលក់ក្នុងពាណិជ្ជកម្មជាមួយ m-CPBA បណ្តាលឱ្យមាន N-oxide 3 ដែលត្រូវគ្នាក្នុងទិន្នផលបរិមាណ។បន្ទាប់ពី 2-aminoazidation នៃ 2 ប្រតិកម្ម cyclocondensation ដែលបានពិពណ៌នាដោយ Abramovich ត្រូវបានអនុវត្តនៅក្នុង benzene នៅ 90 ° C ដើម្បីទទួលបាន 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile ដែលចង់បាន 5 ក្នុងក្រាម។ល្បឿន 60% (ពីរដំណាក់កាល) ។១៥,១៦.Methylation និង hydrolysis នៃ 4 បន្ទាប់មកបានផ្តល់ 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic acid (ហៅថា "cumotonic acid", 6) ក្នុងទិន្នផលល្អ (70%, ពីរជំហាន) ។ជាចុងក្រោយ ការបំភាយតាមរយៈអាស៊ីតក្លរួកម្រិតមធ្យម 6 ដោយប្រើអាម៉ូញាក់ក្នុងទឹកបានផ្តល់ឱ្យ Kumamoto amide 1 ក្នុងទិន្នផល 98% ។ទិន្នន័យវិសាលគមទាំងអស់នៃការសំយោគ 1 គឺស្រដៀងគ្នាទៅនឹងឯកោ 1 ដូច្នេះរចនាសម្ព័ន្ធនៃ 1 ត្រូវបានកំណត់។
ការសំយោគនិងការវិភាគទូទៅនៃសកម្មភាពជីវសាស្រ្តនៃ urbenamide និងអាស៊ីត urbenic ។(ក) ការសំយោគសរុបនៃ Kumamoto amide ។(ខ) កូនឈើប្រភេទ Arabidopsis Columbia (Col) ដែលមានអាយុប្រាំពីរថ្ងៃត្រូវបានដាំដុះនៅលើចាន Murashige និង Skoog (MS) ដែលមានផ្ទុក coumamonamide 6 ឬ coumamonamide 1 នៅកំហាប់ដែលបានចង្អុលបង្ហាញ។របារមាត្រដ្ឋាន = 1 សង់ទីម៉ែត្រ។
ទីមួយ យើងបានវាយតម្លៃសកម្មភាពជីវសាស្រ្តនៃ urbenamide និងសារធាតុអន្តរការីរបស់វាសម្រាប់សមត្ថភាពរបស់ពួកគេក្នុងការកែប្រែការលូតលាស់របស់រុក្ខជាតិ។យើងបានបន្ថែមកំហាប់ផ្សេងៗនៃ ursmonamide 1 ឬអាស៊ីត ursmonic 6 ទៅ MS agar មធ្យម និងបណ្តុះគ្រាប់ពូជ Arabidopsis thaliana នៅលើឧបករណ៍ផ្ទុកនេះ។ការវិភាគទាំងនេះបានបង្ហាញថាកំហាប់ខ្ពស់ (500 μM) នៃ 6 រារាំងការលូតលាស់ឫស (រូបភាព 2b) ។បន្ទាប់មក យើងបានបង្កើតនិស្សន្ទវត្ថុផ្សេងៗដោយជំនួសទីតាំង N1 នៃ 6 និងបានអនុវត្តការសិក្សាទំនាក់ទំនងសកម្មភាពលើពួកវា (ដំណើរការសំយោគអាណាឡូកត្រូវបានពិពណ៌នានៅក្នុងព័ត៌មានជំនួយ (SI))។សំណាប Arabidopsis ត្រូវបានដាំដុះនៅលើឧបករណ៍ផ្ទុកដែលមាននិស្សន្ទវត្ថុអាស៊ីត ursonic 50 μM ហើយប្រវែងឫសត្រូវបានវាស់។ដូចដែលវាបានបង្ហាញនៅលើរូបភាព។ដូចដែលបានបង្ហាញក្នុងរូបភាព 3a, b, និង S1 អាស៊ីត coumamo មានប្រវែងខុសៗគ្នានៃខ្សែសង្វាក់ alkoxy លីនេអ៊ែរ (9, 10, 11, 12, និង 13) ឬខ្សែសង្វាក់ alkoxy ធំ (15, 16, និង 17) នៅទីតាំង N1 ។និស្សន្ទវត្ថុបានបង្ហាញពីការរារាំងយ៉ាងសំខាន់នៃការលូតលាស់របស់ឫស។លើសពីនេះទៀត យើងបានរកឃើញថាការប្រើប្រាស់ 200 μM 10, 11, ឬ 17 inhibited germination (រូបភព 3c និង S2) ។
ការសិក្សាអំពីទំនាក់ទំនងរចនាសម្ព័ន្ធ-សកម្មភាពរបស់ Kumamoto amide និងសមាសធាតុដែលពាក់ព័ន្ធ។(ក) រចនាសម្ព័ន្ធនិងគ្រោងការណ៍សំយោគនៃ analogues ។(b) បរិមាណនៃប្រវែងឫសនៃសំណាបអាយុ 7 ថ្ងៃដែលដាំដុះនៅលើឧបករណ៍ផ្ទុក MS ដោយមានឬគ្មានដេរីវេនៃ coumamonamide 50 μM។សញ្ញាផ្កាយបង្ហាញពីភាពខុសប្លែកគ្នាយ៉ាងសំខាន់ជាមួយនឹងការព្យាបាលការក្លែងបន្លំ (t test, p<0.05)។n>18. ទិន្នន័យត្រូវបានបង្ហាញជាមធ្យម ± SD ។nt មានន័យថា "មិនបានសាកល្បង" ពីព្រោះជាង 50% នៃគ្រាប់ពូជមិនពន្លក។(គ) បរិមាណនៃអត្រាដំណុះនៃគ្រាប់ពូជដែលព្យាបាលដោយ incubated រយៈពេល 7 ថ្ងៃក្នុង MS medium ដោយមានឬគ្មាន 200 μM coumamonamide និងសមាសធាតុដែលពាក់ព័ន្ធ។សញ្ញាផ្កាយបង្ហាញពីភាពខុសប្លែកគ្នាយ៉ាងសំខាន់ជាមួយនឹងការព្យាបាលការក្លែងបន្លំ (ការធ្វើតេស្ត chi-square) ។n=96 ។
គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ ការបន្ថែមខ្សែសង្វាក់ចំហៀង alkyl វែងជាង C9 បានកាត់បន្ថយសកម្មភាពរារាំង ដោយបង្ហាញថាសមាសធាតុដែលទាក់ទងនឹងអាស៊ីត kumamotoic ត្រូវការច្រវាក់ចំហៀងនៃទំហំជាក់លាក់មួយ ដើម្បីបង្ហាញសកម្មភាពជីវសាស្រ្តរបស់ពួកគេ។
ដោយសារតែការវិភាគទំនាក់ទំនងនៃសកម្មភាពរចនាសម្ព័ន្ធបានបង្ហាញថា C9 ត្រូវបានកែប្រែទៅជាអាស៊ីត ursonic និងដេរីវេនៃ nonyloxy នៃអាស៊ីត ursonic (បន្តបន្ទាប់ហៅថា KAND 11) គឺជាថ្នាំទប់ស្កាត់ការលូតលាស់របស់រុក្ខជាតិដែលមានប្រសិទ្ធភាពបំផុត យើងបានធ្វើការកំណត់លក្ខណៈលម្អិតបន្ថែមទៀតនៃ KAND 11 ។ ការព្យាបាល Arabidopsis ជាមួយនឹង 50 μM KAND 11 ស្ទើរតែរារាំងដំណុះបានទាំងស្រុង ចំណែកឯកំហាប់ទាប (40, 30, 20, ឬ 10 μM) នៃ KAND 11 បានរារាំងការលូតលាស់ឫសក្នុងលក្ខណៈអាស្រ័យលើកម្រិតថ្នាំ (រូបភាព 4a, ខ) ។ដើម្បីសាកល្បងថាតើ KAND 11 ប៉ះពាល់ដល់លទ្ធភាពជោគជ័យរបស់ root meristem ដែរឬទេ យើងបានពិនិត្យ meristems ឫសដែលមានស្នាមប្រឡាក់ជាមួយ propidium iodide (PI) និងវាស់ទំហំផ្ទៃ meristem ។ទំហំនៃសំណាបដែលដាំដុះនៅលើឧបករណ៍ផ្ទុកដែលមាន 25 μM KAND-11 គឺ 151.1 ± 32.5 μm ខណៈពេលដែលទំហំនៃ meristem នៃសំណាបដែលដាំដុះនៅលើឧបករណ៍ផ្ទុកដែលមាន DMSO គឺ 264.7 ± 30.8 μm (រូបភាព 4c, d) ដែលបង្ហាញថា KAND-11 ស្តារសកម្មភាពកោសិកាឡើងវិញ។ការរីករាលដាល។ឫស meristem ។ស្របជាមួយនេះ ការព្យាបាលដោយ KAND 11 បានកាត់បន្ថយបរិមាណនៃសញ្ញាសម្គាល់ការបែងចែកកោសិកា CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS signal នៅក្នុង root meristem (រូបភាព 4e) 17 ។លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថា KAND 11 រារាំងការលូតលាស់ឫសដោយកាត់បន្ថយសកម្មភាពរីកសាយកោសិកា។
ការវិភាគនៃឥទ្ធិពលរារាំងនៃនិស្សន្ទវត្ថុអាស៊ីត urbenonic (ដេរីវេនៃ urbenyloxy) លើការលូតលាស់។(ក) កូនពូជ Col ព្រៃអាយុ 7 ថ្ងៃ ដុះលើចាន MS ដែលមានកំហាប់ចង្អុលបង្ហាញនៃ KAND 11 ។ មាត្រដ្ឋាន = 1 សង់ទីម៉ែត្រ។ខ) បរិមាណនៃប្រវែងឫស។អក្សរបង្ហាញពីភាពខុសគ្នាសំខាន់ៗ (ការធ្វើតេស្ត Tukey HSD, ទំ<0.05)។n>16. ទិន្នន័យត្រូវបានបង្ហាញជាមធ្យម ± SD ។(គ) មីក្រូទស្សន៍បង្រួបបង្រួមនៃ propidium iodide-stained wild-type Col roots លូតលាស់នៅលើចាន MS ដោយមានឬគ្មាន 25 μM KAND 11. តង្កៀបពណ៌សបង្ហាញពី root meristem ។របារមាត្រដ្ឋាន = 100 µm ។(d) បរិមាណនៃទំហំ root meristem (n = 10 ទៅ 11) ។ភាពខុសគ្នានៃស្ថិតិត្រូវបានកំណត់ដោយប្រើ t-test (ទំ<0.05)។របារតំណាងឱ្យទំហំ meristem ជាមធ្យម។(ង) មីក្រូទស្សន៍នៃការជ្រៀតជ្រែកឌីផេរ៉ង់ស្យែលឌីផេរ៉ង់ស្យែល (DIC) នៃ meristem ឫសដែលមានរចនាសម្ព័ន្ធ CDKB2 ។1pro: CDKB2;1-GUS ប្រឡាក់និងប្រឡាក់លើសំណាបអាយុ 5 ថ្ងៃដែលដាំដុះនៅលើចាន MS ដោយមានឬគ្មាន 25 µM KAND assay ។
phytotoxicity នៃ KAND 11 ត្រូវបានធ្វើតេស្តបន្ថែមដោយប្រើរុក្ខជាតិ dicotyledonous មួយផ្សេងទៀត ថ្នាំជក់ (Nicotiana tabacum) និងសារពាង្គកាយគំរូរុក្ខជាតិដីដ៏សំខាន់មួយគឺ liverwort (Marchantia polymorpha) ។ដូចនៅក្នុងករណីនៃ Arabidopsis សំណាបថ្នាំជក់ SR-1 ដែលដាំដុះនៅលើមធ្យមដែលមាន 25 μM KAND 11 បានបង្កើតឫសខ្លី (រូបភាព 5a) ។លើសពីនេះទៀត គ្រាប់ពូជ 40 ក្នុងចំណោម 48 គ្រាប់បានដុះនៅលើចានដែលមានផ្ទុក 200 μM KAND 11 ចំណែកឯគ្រាប់ពូជទាំង 48 គ្រាប់បានដុះនៅលើប្រព័ន្ធផ្សព្វផ្សាយដែលព្យាបាលដោយក្លែងក្លាយ ដែលបង្ហាញថាកំហាប់ខ្ពស់នៃ KAND មានសារៈសំខាន់ (ទំ។< 0.05;ការធ្វើតេស្ត chi -square) រារាំងដំណុះរបស់ថ្នាំជក់។(រូបភាព 5 ខ) ។លើសពីនេះទៀតការផ្តោតអារម្មណ៍នៃ KAND 11 ដែលរារាំងការលូតលាស់នៃបាក់តេរីនៅក្នុង liverwort គឺស្រដៀងគ្នាទៅនឹងកំហាប់មានប្រសិទ្ធភាពនៅក្នុង Arabidopsis (រូបភាព 5c) ។លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថា KAND 11 អាចរារាំងការលូតលាស់របស់រុក្ខជាតិផ្សេងៗ។បន្ទាប់មក យើងបានធ្វើការស៊ើបអង្កេតលើការពុលស៊ីតូតូតូស៊ីតនៃសមាសធាតុដែលទាក់ទងនឹងសត្វខ្លាឃ្មុំ monoamide នៅក្នុងសារពាង្គកាយផ្សេងទៀត ដូចជាកោសិកា HeLa របស់មនុស្ស និង Escherichia coli strain DH5α ដែលជាតំណាងនៃកោសិកាសត្វ និងបាក់តេរីខ្ពស់ជាងរៀងគ្នា។នៅក្នុងស៊េរីនៃការវិភាគការរីកសាយកោសិកា យើងសង្កេតឃើញថា coumamonamide 1, coumamonamidic acid 6 និង KAND 11 មិនប៉ះពាល់ដល់ការលូតលាស់នៃកោសិកា HeLa ឬ E. coli នៅកំហាប់ 100 μM (រូបភាព 5d, e) ទេ។
ការរារាំងការលូតលាស់របស់ KAND 11 នៅក្នុងសារពាង្គកាយដែលមិនមែនជា Arabidopsis ។(ក) សំណាបថ្នាំជក់ប្រភេទ SR-1 ព្រៃអាយុពីរសប្តាហ៍ត្រូវបានដាំដុះនៅលើចាន MS បញ្ឈរដែលមានផ្ទុក 25 μM KAND 11។ (ខ) សំណាបថ្នាំជក់ប្រភេទ SR-1 ព្រៃអាយុពីរសប្តាហ៍ត្រូវបានដាំដុះនៅលើទីតាំងផ្ដេក។ ចាន MS មានផ្ទុក 200 μM KAND 11. (គ) គ្រាប់ល្ហុងទុំប្រភេទ Tak-1 ដែលមានអាយុពីរសប្តាហ៍ដែលដុះនៅលើចាន Gamborg B5 ជាមួយនឹងកំហាប់នៃ KAND 11។ ព្រួញក្រហមបង្ហាញពី spores ដែលបញ្ឈប់ការលូតលាស់ក្នុងរយៈពេលពីរសប្តាហ៍។ រយៈពេល។(ឃ) ការវិភាគការរីកសាយកោសិកានៃកោសិកា HeLa ។ចំនួនកោសិកាដែលអាចដំណើរការបានត្រូវបានវាស់នៅចន្លោះពេលកំណត់ដោយប្រើឧបករណ៍រាប់ក្រឡា 8 (Dojindo)។ក្នុងនាមជាការគ្រប់គ្រង កោសិកា HeLa ត្រូវបានព្យាបាលដោយ 5 μg/ml actinomycin D (Act D) ដែលរារាំងការចម្លង RNA polymerase និងបណ្តាលឱ្យស្លាប់កោសិកា។ការវិភាគត្រូវបានអនុវត្តជាបីដង។(ង) ការវិភាគការរីកសាយកោសិកា E. coli ។ការលូតលាស់របស់ E. coli ត្រូវបានវិភាគដោយការវាស់វែង OD600។ក្នុងនាមជាការគ្រប់គ្រង កោសិកាត្រូវបានព្យាបាលដោយ 50 μg/ml ampicillin (Amp) ដែលរារាំងការសំយោគជញ្ជាំងកោសិកាបាក់តេរី។ការវិភាគត្រូវបានអនុវត្តជាបីដង។
ដើម្បីបកស្រាយយន្តការនៃសកម្មភាពនៃជាតិពុល cytotoxicity ដែលបណ្តាលមកពីសមាសធាតុដែលទាក់ទងនឹង uramide យើងបានវិភាគឡើងវិញនូវដេរីវេនៃអាស៊ីត urbenic ជាមួយនឹងឥទ្ធិពល inhibitory កម្រិតមធ្យម។ដូចដែលវាបានបង្ហាញនៅលើរូបភាព។ដូចដែលបានបង្ហាញក្នុងរូបភាព 2b, 6a សំណាបដែលដាំដុះនៅលើចាន agar ដែលមានកំហាប់ខ្ពស់ (200 μM) នៃអាស៊ីត urmotonic 6 បានផលិតឫសខ្លី និងកោងខាងឆ្វេង (θ = – 23.7 ± 6.1) ចំណែកឯសំណាបដែលដាំដុះនៅលើឧបករណ៍បញ្ជានោះ សំណាបបង្កើតបានឫសត្រង់ (θ = – 3.8 ± 7.1) ។ការលូតលាស់ oblique លក្ខណៈនេះត្រូវបានគេដឹងថាបណ្តាលមកពីការមិនដំណើរការនៃ microtubules cortical 14,18 ។ស្របជាមួយនឹងការរកឃើញនេះ ថ្នាំដែលបំផ្លាញ microtubule-destabilizing disopyramide និង oryzalin បណ្តាលឱ្យមានឫសស្រដៀងគ្នានៅក្រោមលក្ខខណ្ឌលូតលាស់របស់យើង (រូបភាព 2b, 6a) ។ក្នុងពេលជាមួយគ្នានេះ យើងបានសាកល្បងនិស្សន្ទវត្ថុអាស៊ីត urmotonic និងបានជ្រើសរើសពួកវាមួយចំនួន ដែលនៅកំហាប់ជាក់លាក់ ជំរុញឱ្យមានការរីកលូតលាស់នៃឫស oblique ។សមាសធាតុ 8, 9, និង 15 បានផ្លាស់ប្តូរទិសដៅនៃការលូតលាស់របស់ឫសនៅ 75 μM, 50 μM, និង 40 μM រៀងគ្នា ដោយបង្ហាញថាសមាសធាតុទាំងនេះអាចធ្វើអោយអស្ថិរភាព microtubules (រូបភាព 2b, 6a)។យើងក៏បានសាកល្បងនូវដេរីវេនៃអាស៊ីត ursolic ដ៏មានឥទ្ធិពលបំផុត KAND 11 នៅកំហាប់ទាប (15 µM) ហើយបានរកឃើញថាការប្រើប្រាស់ KAND 11 រារាំងការលូតលាស់របស់ឫស ហើយទិសដៅនៃការលូតលាស់របស់ឫសគឺមិនស្មើគ្នា ទោះបីជាពួកគេមានទំនោរទៅខាងឆ្វេងក៏ដោយ ( រូបភាព C3) ។.ដោយសារតែកំហាប់ខ្ពស់នៃថ្នាំ microtubule-destabilizing ជួនកាលរារាំងការលូតលាស់របស់រុក្ខជាតិជាជាងបណ្តាលឱ្យមានការរមួលឫស យើងបានវាយតម្លៃជាបន្តបន្ទាប់នូវលទ្ធភាពដែល KAND 11 ប៉ះពាល់ដល់ microtubules ដោយសង្កេតមើល microtubules cortical នៅក្នុងកោសិកា epidermal root ។Immunohistochemistry ដោយប្រើអង្គបដិបក្ខប្រឆាំងនឹងβ-tubulin នៅក្នុងកោសិកា epidermal នៃឫសសំណាបដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ 25 μM KAND 11 បានបង្ហាញពីការបាត់ខ្លួនស្ទើរតែទាំងអស់នៃ microtubules cortical នៅក្នុងកោសិកា epidermal នៅក្នុងតំបន់ពន្លូត (រូបភាព 6b) ។លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថាអាស៊ីត kumamotonic និងនិស្សន្ទវត្ថុរបស់វាធ្វើសកម្មភាពដោយផ្ទាល់ ឬដោយប្រយោលលើ microtubules ដើម្បីរំខានពួកវា ហើយសមាសធាតុទាំងនេះគឺជាសារធាតុទប់ស្កាត់ microtubule ប្រលោមលោក។
អាស៊ីត Ursonic និងនិស្សន្ទវត្ថុរបស់វាផ្លាស់ប្តូរ microtubules cortical នៅក្នុង Arabidopsis thaliana ។(ក) មុំទំនោររបស់ឫសត្រូវបានវាស់នៅក្នុងវត្តមាននៃដេរីវេនៃអាស៊ីត urmotonic ផ្សេងៗនៅកំហាប់ដែលបានចង្អុលបង្ហាញ។ផលប៉ះពាល់នៃសមាសធាតុពីរដែលគេស្គាល់ថារារាំង microtubules: disopyramide និង oryzalin ក៏ត្រូវបានវិភាគផងដែរ។ធាតុបញ្ចូលបង្ហាញស្តង់ដារដែលប្រើដើម្បីវាស់មុំលូតលាស់ឫស។សញ្ញាផ្កាយបង្ហាញពីភាពខុសប្លែកគ្នាយ៉ាងសំខាន់ជាមួយនឹងការព្យាបាលការក្លែងបន្លំ (t test, p<0.05)។n>19. របារមាត្រដ្ឋាន = 1 សង់ទីម៉ែត្រ។(b) Cortical microtubules នៅក្នុងកោសិកា epidermal នៅក្នុងតំបន់ពន្លូត។Microtubules នៅក្នុងឫស Arabidopsis Col ប្រភេទព្រៃដែលដុះនៅលើចាន MS ដោយមានឬគ្មាន 25 μM KAND 11 ត្រូវបានគេមើលឃើញដោយស្នាមប្រឡាក់ immunohistochemical ដោយប្រើអង់ទីករបឋម β-tubulin និងអង្គបដិប្រាណបន្ទាប់បន្សំ Alexa Fluor-conjugated ។របារមាត្រដ្ឋាន = 10 µm ។(គ) រចនាសម្ព័ន Mitotic នៃ microtubules នៅក្នុង meristem ឫស។Microtubules ត្រូវបានគេមើលឃើញដោយប្រើស្នាមប្រឡាក់ immunohistochemical ។រចនាសម្ព័ន្ធ Mitotic រួមទាំងតំបន់ prophase, spindles និង phragmoplasts ត្រូវបានរាប់ពីរូបភាពប្រសព្វ។ព្រួញបង្ហាញពីរចនាសម្ព័ន្ធ mitotic microtubule ។សញ្ញាផ្កាយបង្ហាញពីភាពខុសប្លែកគ្នាយ៉ាងសំខាន់ជាមួយនឹងការព្យាបាលការក្លែងបន្លំ (t test, p<0.05)។n>9. របារមាត្រដ្ឋាន = 50 µm ។
ទោះបីជា Ursa មានសមត្ថភាពក្នុងការរំខានដល់មុខងារ microtubule ក៏ដោយ យន្តការនៃសកម្មភាពរបស់វាត្រូវបានគេរំពឹងថានឹងខុសពីភ្នាក់ងារ depolymerizing microtubule ធម្មតា។ឧទាហរណ៍ កំហាប់ខ្ពស់នៃភ្នាក់ងារ depolymerizing microtubule ដូចជា disopyramide និង oryzalin បណ្តាលឱ្យមានការពង្រីក anisotropic នៃកោសិកា epidermal ចំណែក KAND 11 មិនមាន។លើសពីនេះទៀត ការប្រើប្រាស់រួមគ្នានៃ KAND 11 និង disopyramide បណ្តាលឱ្យមានការឆ្លើយតបនៃការលូតលាស់ឫសដែលបណ្តាលមកពី disopyramide និងការទប់ស្កាត់ការលូតលាស់ដែលបណ្តាលមកពី KAND 11 ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញ (រូបភាព S4) ។យើងក៏បានវិភាគទៅលើការឆ្លើយតបនៃការផ្លាស់ប្តូរប្រតិកម្ម disopyramide 1-1 (phs1-1) ទៅ KAND 11 ។ phs1-1 មានការផ្លាស់ប្តូរចំណុច tubulin kinase ដែលមិនមែនជា canonical និងបង្កើតឫសខ្លីជាងនៅពេលព្យាបាលដោយ disopyramide9,20 ។phs1-1 សំណាប mutant ដែលដាំដុះនៅលើឧបករណ៍ផ្ទុក agar ដែលមាន KAND 11 មានឫសខ្លីជាងស្រដៀងនឹងគ្រាប់ពូជដែលដាំដុះនៅលើ disopyramid (រូបភព S5) ។
លើសពីនេះ យើងបានសង្កេតឃើញរចនាសម្ព័ន្ធ mitotic microtubule ដូចជាតំបន់ prophase, spindles និង phragmoplasts នៅក្នុង root meristem នៃសំណាបដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ KAND 11។ ស្របតាមការសង្កេតសម្រាប់ CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS ការថយចុះគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៅក្នុង ចំនួននៃ microtubules mitotic ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញ (រូបភាព .6c) ។
ដើម្បីកំណត់លក្ខណៈនៃ cytotoxicity នៃ KAND 11 នៅកម្រិតកោសិការង យើងបានព្យាបាលកោសិកាព្យួរថ្នាំជក់ BY-2 ជាមួយ KAND 11 ហើយបានសង្កេតមើលការឆ្លើយតបរបស់វា។ដំបូងយើងបានបន្ថែម KAND 11 ទៅកោសិកា BY-2 ដែលបង្ហាញពី TagRFP-TUA6 ដែលដាក់ស្លាក fluorescently microtubules ដើម្បីវាយតម្លៃឥទ្ធិពលនៃ KAND 11 លើ microtubules cortical ។ដង់ស៊ីតេ microtubule Cortical ត្រូវបានវាយតម្លៃដោយប្រើការវិភាគរូបភាព ដែលកំណត់ចំនួនភាគរយនៃភីកសែល cytoskeletal ក្នុងចំណោមភីកសែល cytoplasmic ។លទ្ធផលនៃការវិភាគបានបង្ហាញថាបន្ទាប់ពីការព្យាបាលជាមួយ 50 μM ឬ 100 μM KAND 11 រយៈពេល 1 ម៉ោង ដង់ស៊ីតេបានថយចុះយ៉ាងខ្លាំងមកត្រឹម 0.94 ± 0.74% ឬ 0.23 ± 0.28% រៀងគ្នា ខណៈពេលដែលដង់ស៊ីតេនៃកោសិកាដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ DMSO , មានចំនួនដល់ទៅ 0.94 ± 1 ។ % (រូបទី 7 ក)។លទ្ធផលទាំងនេះគឺស្របនឹងការសង្កេតនៅក្នុង Arabidopsis ថា ការព្យាបាល KAND 11 ជំរុញឱ្យមានការ depolymerization នៃ microtubules cortical (រូបភាព 6b) ។យើងក៏បានពិនិត្យខ្សែ BY-2 ជាមួយនឹងសរសៃ actin ដែលមានស្លាក GFP-ABD បន្ទាប់ពីការព្យាបាលជាមួយនឹងកំហាប់ដូចគ្នានៃ KAND 11 ហើយបានសង្កេតឃើញថា ការព្យាបាល KAND 11 រំខានដល់សរសៃ actin ។ការព្យាបាលដោយ 50 μM ឬ 100 μM KAND 11 សម្រាប់រយៈពេល 1 ម៉ោងបានកាត់បន្ថយយ៉ាងខ្លាំងនូវដង់ស៊ីតេសរសៃ actin ដល់ 1.20 ± 0.62% ឬ 0.61 ± 0.26% រៀងគ្នា ចំណែកឯដង់ស៊ីតេនៅក្នុងកោសិកាដែលព្យាបាលដោយ DMSO គឺ 1.69 ± 0.2% ។៧ ខ).លទ្ធផលទាំងនេះផ្ទុយទៅនឹងឥទ្ធិពលរបស់ propyzamide ដែលមិនប៉ះពាល់ដល់សរសៃ actin និង latrunculin B ដែលជាសារធាតុ depolymerizer actin ដែលមិនប៉ះពាល់ដល់ microtubules (SI រូបភាព S6) ។លើសពីនេះទៀត ការព្យាបាលដោយ coumamonamide 1, coumamonamide acid 6, ឬ KAND 11 មិនប៉ះពាល់ដល់ microtubules នៅក្នុងកោសិកា HeLa (SI រូបភាព S7) ទេ។ដូច្នេះ យន្តការនៃសកម្មភាពរបស់ KAND 11 ត្រូវបានគេជឿថាខុសពីការរំខាននៃ cytoskeleton ដែលគេស្គាល់។លើសពីនេះទៀតការសង្កេតមីក្រូទស្សន៍របស់យើងនៃកោសិកា BY-2 ដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ KAND 11 បានបង្ហាញពីការចាប់ផ្តើមនៃការស្លាប់កោសិកាក្នុងអំឡុងពេលនៃការព្យាបាល KAND 11 ហើយបានបង្ហាញថាសមាមាត្រនៃកោសិកាស្លាប់ដែលមានស្នាមប្រឡាក់ពណ៌ខៀវរបស់ Evans មិនកើនឡើងគួរឱ្យកត់សម្គាល់បន្ទាប់ពី 30 នាទីនៃការព្យាបាល KAND 11 ចំណែកឯ បន្ទាប់ពី 90 នាទីនៃការព្យាបាលជាមួយនឹង 50 μM ឬ 100 μM KAND ចំនួននៃកោសិកាស្លាប់បានកើនឡើងដល់ 43.7% ឬ 80.1% រៀងគ្នា (រូបភាព 7c) ។សរុបមក ទិន្នន័យទាំងនេះបង្ហាញថា ដេរីវេនៃអាស៊ីត ursolic ប្រលោមលោក KAND 11 គឺជាថ្នាំទប់ស្កាត់ cytoskeletal ជាក់លាក់របស់រុក្ខជាតិជាមួយនឹងយន្តការនៃសកម្មភាពដែលមិនស្គាល់ពីមុន។
KAND ប៉ះពាល់ដល់ microtubules cortical, actin filaments និងលទ្ធភាពជោគជ័យនៃកោសិកាថ្នាំជក់ BY-2 ។(a) ការមើលឃើញនៃ microtubules cortical នៅក្នុងកោសិកា BY-2 នៅក្នុងវត្តមានរបស់ TagRFP-TUA6 ។កោសិកា BY-2 ដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ KAND 11 (50 μM ឬ 100 μM) ឬ DMSO ត្រូវបានពិនិត្យដោយមីក្រូទស្សន៍បង្រួម។ដង់ស៊ីតេ microtubule Cortical ត្រូវបានគណនាពីមីក្រូក្រាហ្វនៃកោសិកាឯករាជ្យចំនួន 25 ។អក្សរបង្ហាញពីភាពខុសគ្នាសំខាន់ៗ (ការធ្វើតេស្ត Tukey HSD, ទំ<0.05)។របារមាត្រដ្ឋាន = 10 µm ។(b) សរសៃ Cortical actin នៅក្នុងកោសិកា BY-2 ដែលមើលឃើញនៅក្នុងវត្តមាននៃ GFP-ABD2 ។កោសិកា BY-2 ដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ KAND 11 (50 μM ឬ 100 μM) ឬ DMSO ត្រូវបានពិនិត្យដោយមីក្រូទស្សន៍បង្រួម។ដង់ស៊ីតេនៃសរសៃ actin cortical ត្រូវបានគណនាពីមីក្រូក្រាហ្វនៃកោសិកាឯករាជ្យចំនួន 25 ។អក្សរបង្ហាញពីភាពខុសគ្នាសំខាន់ៗ (ការធ្វើតេស្ត Tukey HSD, ទំ<0.05)។របារមាត្រដ្ឋាន = 10 µm ។(គ) ការសង្កេតលើកោសិកា BY-2 ដែលស្លាប់ដោយស្នាមប្រឡាក់ពណ៌ខៀវ Evans ។កោសិកា BY-2 ដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ KAND 11 (50 μM ឬ 100 μM) ឬ DMSO ត្រូវបានពិនិត្យដោយមីក្រូទស្សន៍ពន្លឺ។n=3.របារមាត្រដ្ឋាន = 100 µm ។
របកគំហើញ និងការអនុវត្តផលិតផលធម្មជាតិថ្មីបាននាំឱ្យមានការជឿនលឿនយ៉ាងសំខាន់ក្នុងទិដ្ឋភាពផ្សេងៗនៃជីវិតមនុស្ស រួមទាំងថ្នាំពេទ្យ និងកសិកម្ម។ការស្រាវជ្រាវប្រវត្តិសាស្ត្រត្រូវបានអនុវត្តដើម្បីទទួលបានសមាសធាតុមានប្រយោជន៍ពីធនធានធម្មជាតិ។ជាពិសេស actinomycetes ត្រូវបានគេដឹងថាមានប្រយោជន៍ជាថ្នាំអង់ទីប៊ីយោទិចប្រឆាំងនឹងប៉ារ៉ាស៊ីតសម្រាប់ nematodes ដោយសារតែសមត្ថភាពរបស់វាក្នុងការផលិតសារធាតុមេតាបូលីតបន្ទាប់បន្សំជាច្រើនដូចជា avermectin ដែលជាសមាសធាតុនាំមុខនៃ ivermectin និង bleomycin និងនិស្សន្ទវត្ថុរបស់វា ដែលប្រើប្រាស់ជាឱសថជាភ្នាក់ងារប្រឆាំងមហារីក 21,22។ដូចគ្នានេះដែរ សមាសធាតុថ្នាំសំលាប់ស្មៅជាច្រើនប្រភេទត្រូវបានរកឃើញពី actinomycetes ដែលមួយចំនួនត្រូវបានប្រើប្រាស់រួចហើយក្នុងពាណិជ្ជកម្ម1,23។ដូច្នេះការវិភាគនៃសារធាតុរំលាយអាហារ actinomycete ដើម្បីញែកផលិតផលធម្មជាតិដោយសកម្មភាពជីវសាស្រ្តដែលចង់បានត្រូវបានចាត់ទុកថាជាយុទ្ធសាស្រ្តដ៏មានប្រសិទ្ធភាព។នៅក្នុងការសិក្សានេះ យើងបានរកឃើញសមាសធាតុថ្មីមួយគឺ coumamonamide ពី S. werraensis ហើយបានសំយោគវាដោយជោគជ័យ។អាស៊ីត Ursonic គឺជាកម្រិតមធ្យមសំយោគនៃ urbenamide និងនិស្សន្ទវត្ថុរបស់វា។វាអាចបណា្តាលឱ្រយមនលក្ខណៈជា root curling បង្ហាញសកម្មភាពថ្នាំសំលាប់ស្មៅពីមធ្យមទៅខ្លាំង និងបំផ្លាញ microtubules រុក្ខជាតិដោយផ្ទាល់ ឬដោយប្រយោល។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ យន្តការនៃសកម្មភាពនៃអាស៊ីត urmotonic អាចខុសពីថ្នាំទប់ស្កាត់ microtubule ដែលមានស្រាប់ ចាប់តាំងពី KAND 11 ក៏រំខានដល់សរសៃ actin និងបណ្តាលឱ្យស្លាប់កោសិកា ដែលបង្ហាញពីយន្តការនិយតកម្មដែលអាស៊ីត urmotonic និងនិស្សន្ទវត្ថុរបស់វាមានឥទ្ធិពលលើរចនាសម្ព័ន្ធ cytoskeletal យ៉ាងទូលំទូលាយ។.
លក្ខណៈលម្អិតបន្ថែមទៀតនៃអាស៊ីត urbenonic នឹងជួយឱ្យយល់កាន់តែច្បាស់អំពីយន្តការនៃសកម្មភាពនៃអាស៊ីត urbenonic ។ជាពិសេស គោលដៅបន្ទាប់គឺដើម្បីវាយតម្លៃសមត្ថភាពនៃអាស៊ីត ursonic ក្នុងការភ្ជាប់ទៅនឹង microtubules កាត់បន្ថយដើម្បីកំណត់ថាតើអាស៊ីត ursonic និងនិស្សន្ទវត្ថុរបស់វាធ្វើសកម្មភាពដោយផ្ទាល់លើ microtubules និង depolymerize ពួកវា ឬថាតើសកម្មភាពរបស់ពួកគេបណ្តាលឱ្យមានអស្ថិរភាពនៃ microtubule ។លើសពីនេះទៀត ក្នុងករណីដែល microtubules មិនមែនជាគោលដៅផ្ទាល់ ការកំណត់ទីតាំងនៃសកម្មភាព និងគោលដៅម៉ូលេគុលនៃអាស៊ីត ursonic នៅលើកោសិការុក្ខជាតិ នឹងជួយឱ្យយល់កាន់តែច្បាស់អំពីលក្ខណៈសម្បត្តិនៃសមាសធាតុដែលពាក់ព័ន្ធ និងវិធីដែលអាចធ្វើទៅបានដើម្បីកែលម្អសកម្មភាពថ្នាំសំលាប់ស្មៅ។ការវិភាគជីវសកម្មរបស់យើងបានបង្ហាញពីសមត្ថភាព cytotoxic តែមួយគត់នៃអាស៊ីត ursonic លើការលូតលាស់របស់រុក្ខជាតិដូចជា Arabidopsis thaliana, ថ្នាំជក់ និង liverwort ខណៈពេលដែលកោសិកា E. coli និង HeLa មិនរងផលប៉ះពាល់។ការពុលតិចតួចឬគ្មានចំពោះកោសិកាសត្វគឺជាអត្ថប្រយោជន៍នៃដេរីវេនៃអាស៊ីត ursonic ប្រសិនបើពួកវាត្រូវបានបង្កើតឡើងជាថ្នាំសំលាប់ស្មៅសម្រាប់ប្រើប្រាស់ក្នុងវិស័យកសិកម្មបើកចំហ។ជាការពិតណាស់ ដោយសារ microtubules គឺជារចនាសម្ព័ន្ធទូទៅនៅក្នុង eukaryotes ការទប់ស្កាត់ការជ្រើសរើសរបស់ពួកគេនៅក្នុងរុក្ខជាតិគឺជាតម្រូវការសំខាន់សម្រាប់ថ្នាំសំលាប់ស្មៅ។ឧទាហរណ៍ propyzamide ដែលជាភ្នាក់ងារ depolymerizing microtubule ដែលភ្ជាប់ដោយផ្ទាល់ទៅនឹង tubulin និងរារាំងវត្ថុធាតុ polymerization ត្រូវបានគេប្រើជាថ្នាំសំលាប់ស្មៅដោយសារតែការពុលទាបរបស់វាចំពោះកោសិកាសត្វ24។ផ្ទុយទៅនឹង disopyramide, benzamides ពាក់ព័ន្ធមានភាពជាក់លាក់គោលដៅផ្សេងគ្នា។បន្ថែមពីលើ microtubules រុក្ខជាតិ RH-4032 ឬ benzoxamide ក៏រារាំង microtubules នៃកោសិកាសត្វ ឬ oomycetes រៀងគ្នា ហើយ zalilamide ត្រូវបានគេប្រើជាថ្នាំសម្លាប់ផ្សិតដោយសារតែ phytotoxicity ទាបរបស់វា 25,26,27 ។សត្វខ្លាឃ្មុំដែលទើបនឹងរកឃើញ និងនិស្សន្ទវត្ថុរបស់វាបង្ហាញសារធាតុ cytotoxicity ប្រឆាំងនឹងរុក្ខជាតិ ប៉ុន្តែគួរកត់សំគាល់ថាការកែប្រែបន្ថែមអាចផ្លាស់ប្តូរភាពជាក់លាក់គោលដៅរបស់វា ដែលអាចផ្តល់នូវនិស្សន្ទវត្ថុបន្ថែមសម្រាប់ការគ្រប់គ្រងផ្សិតបង្កជំងឺ ឬ omycetes ។
លក្ខណៈសម្បត្តិពិសេសនៃអាស៊ីត urbenonic និងនិស្សន្ទវត្ថុរបស់វាមានប្រយោជន៍សម្រាប់ការអភិវឌ្ឍរបស់ពួកគេជាថ្នាំសំលាប់ស្មៅ និងប្រើប្រាស់ជាឧបករណ៍ស្រាវជ្រាវ។សារៈសំខាន់នៃ cytoskeleton ក្នុងការគ្រប់គ្រងរូបរាងកោសិការុក្ខជាតិត្រូវបានទទួលស្គាល់យ៉ាងទូលំទូលាយ។ការសិក្សាពីមុនបានបង្ហាញថា រុក្ខជាតិបានវិវត្តនូវយន្តការស្មុគស្មាញនៃអង្គការ cortical microtubule ដោយគ្រប់គ្រងថាមវន្ត microtubule ដើម្បីគ្រប់គ្រង morphogenesis ឱ្យបានត្រឹមត្រូវ។មួយចំនួនធំនៃម៉ូលេគុលដែលទទួលខុសត្រូវចំពោះបទប្បញ្ញត្តិនៃសកម្មភាព microtubule ត្រូវបានគេកំណត់អត្តសញ្ញាណ ហើយការស្រាវជ្រាវដែលពាក់ព័ន្ធនៅតែកំពុងបន្ត 3,4,28។ការយល់ដឹងនាពេលបច្ចុប្បន្នរបស់យើងអំពីថាមវន្ត microtubule នៅក្នុងកោសិការុក្ខជាតិមិនពន្យល់យ៉ាងពេញលេញអំពីយន្តការនៃអង្គការ cortical microtubule ទេ។ឧទាហរណ៍ ទោះបីជា disopyramide និង oryzalin អាច depolymerize microtubules ក៏ដោយ disopyramide បណ្តាលឱ្យខូចទ្រង់ទ្រាយឫសយ៉ាងធ្ងន់ធ្ងរ ខណៈដែល oryzalin មានឥទ្ធិពលស្រាល។លើសពីនេះទៅទៀត ការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុង tubulin ដែលធ្វើអោយ microtubules មានស្ថេរភាព ក៏បណ្តាលឱ្យមាន dextrorotation នៅក្នុងឫស ចំណែក paclitaxel ដែលធ្វើអោយ microtubule dynamic dynamics ក៏មិនមានលក្ខណៈដែរ។ដូច្នេះ ការសិក្សា និងកំណត់គោលដៅម៉ូលេគុលនៃអាស៊ីត ursolic គួរតែផ្តល់នូវការយល់ដឹងថ្មីអំពីបទប្បញ្ញត្តិនៃ microtubules cortical របស់រុក្ខជាតិ។ដូចគ្នានេះដែរ ការប្រៀបធៀបនាពេលអនាគតនៃសារធាតុគីមីដែលមានប្រសិទ្ធភាពក្នុងការលើកកម្ពស់ការលូតលាស់ដែលខូចទ្រង់ទ្រាយ ដូចជា disopyramide និងសារធាតុគីមីដែលមានប្រសិទ្ធភាពតិចជាង ដូចជា oryzalin ឬអាស៊ីត kumamotoric នឹងផ្តល់តម្រុយអំពីរបៀបដែលការលូតលាស់ខុសប្រក្រតីកើតឡើង។
ម៉្យាងវិញទៀត ការរៀបចំឡើងវិញ cytoskeletal ដែលទាក់ទងនឹងការការពារ គឺជាលទ្ធភាពមួយផ្សេងទៀតដើម្បីពន្យល់ពី cytotoxicity នៃអាស៊ីត ursonic ។ការឆ្លងមេរោគ ឬការដាក់បញ្ចូលសារធាតុអេលីស៊ីទ័រ ចូលទៅក្នុងកោសិការុក្ខជាតិ ជួនកាលបណ្តាលឱ្យមានការបំផ្លាញ ស៊ីតូស្កេតុន និងការស្លាប់កោសិកាជាបន្តបន្ទាប់ 29.ឧទាហរណ៍ Cryptoxanthin ដែលទទួលបានពី oomycete ត្រូវបានគេរាយការណ៍ថាបានរំខានដល់ microtubules និង actin filaments មុនពេលស្លាប់កោសិកាថ្នាំជក់ ស្រដៀងទៅនឹងអ្វីដែលកើតឡើងជាមួយ KAND treatment30,31។ភាពស្រដៀងគ្នារវាងការឆ្លើយតបការពារ និងការឆ្លើយតបកោសិកាដែលបង្កឡើងដោយអាស៊ីត ursonic បាននាំឱ្យយើងសន្មត់ថាពួកវាបង្កឱ្យមានដំណើរការកោសិកាទូទៅ ទោះបីជាឥទ្ធិពលលឿន និងខ្លាំងនៃអាស៊ីត ursonic ជាង cryptoxanthin ត្រូវបានបង្ហាញឱ្យឃើញក៏ដោយ។ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការសិក្សាបានបង្ហាញថាការរំខាននៃសរសៃ actin ជំរុញការស្លាប់កោសិកាដោយឯកឯង ដែលមិនតែងតែអមដោយការរំខានដល់ microtubule 29 ។លើសពីនេះ វានៅតែត្រូវមើលថាតើភ្នាក់ងារបង្ករោគ ឬសារធាតុអេលីស៊ីទ័រ បណ្តាលឱ្យមានការលូតលាស់ឫសខុសប្រក្រតី ដូចដេរីវេនៃអាស៊ីត ursonic ដែរឬអត់។ដូច្នេះ ចំនេះដឹងម៉ូលេគុលដែលភ្ជាប់ការឆ្លើយតបការពារ និង ស៊ីតូស្គីលតុន គឺជាបញ្ហាដ៏ទាក់ទាញមួយដែលត្រូវដោះស្រាយ។ដោយការកេងប្រវ័ញ្ចវត្តមាននៃសមាសធាតុទម្ងន់ម៉ូលេគុលទាបដែលទាក់ទងនឹងអាស៊ីត ursonic ក៏ដូចជាបណ្តុំនៃដេរីវេដែលមានសក្តានុពលផ្សេងៗគ្នា ពួកគេអាចផ្តល់ឱកាសដើម្បីកំណត់គោលដៅនៃយន្តការកោសិកាដែលមិនស្គាល់។
រួមគ្នា របកគំហើញ និងការអនុវត្តនៃសមាសធាតុថ្មីដែលកែប្រែថាមវន្ត microtubule នឹងផ្តល់នូវវិធីសាស្រ្តដ៏មានអានុភាពដើម្បីដោះស្រាយយន្តការម៉ូលេគុលដ៏ស្មុគស្មាញដែលស្ថិតនៅក្រោមការកំណត់រូបរាងកោសិការុក្ខជាតិ។នៅក្នុងបរិបទនេះ សមាសធាតុអាស៊ីត urmotonic ដែលទើបនឹងបង្កើតថ្មីៗ ដែលប៉ះពាល់ដល់ microtubules និង actin filaments និងបណ្តាលឱ្យស្លាប់កោសិកា អាចផ្តល់ឱកាសមួយដើម្បី decipher ការតភ្ជាប់រវាង microtubule control និងយន្តការផ្សេងទៀតទាំងនេះ។ដូច្នេះ ការវិភាគគីមី និងជីវសាស្រ្តដោយប្រើអាស៊ីត urbenonic នឹងជួយយើងឱ្យយល់អំពីយន្តការនិយតកម្មម៉ូលេគុលដែលគ្រប់គ្រង cytoskeleton របស់រុក្ខជាតិ។
Inoculate S. werraensis MK493-CF1 ទៅក្នុងដប Erlenmeyer ចំណុះ 500 mL ដែលមានផ្ទុកគ្រាប់ពូជ 110 mL ដែលមានសារធាតុ galactose 2% (w/v) 2% (w/v) Essence paste, 1% (w/v) សមាសភាព Bacto .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) ចំរាញ់ពោត (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0.2% (w/v) (NH4) 2SO4 និង 0.2% CaCO3 ក្នុងទឹក deionized ។(pH 7.4 មុនពេលក្រៀវ) ។វប្បធម៌គ្រាប់ពូជត្រូវបាន incubated នៅលើ rotary shaker (180 rpm) នៅ 27 ° C រយៈពេល 2 ថ្ងៃ។ការដាំដុះផលិតកម្មតាមរយៈការ fermentation រដ្ឋរឹង។វប្បធម៌គ្រាប់ពូជ (7 មីលីលីត្រ) ត្រូវបានផ្ទេរទៅក្នុងដប 500 មីលីលីត្រ K-1 ដែលមានផ្ទុក 40 ក្រាមនៃសម្ភារៈផលិតដែលមាន 15 ក្រាមនៃ barley ចុច (ក្រុមហ៊ុន MUSO Co., Ltd., ប្រទេសជប៉ុន) និង 25 ក្រាមនៃទឹក deionized (pH មិនត្រូវបានកែតម្រូវ។ មុនពេលក្រៀវ) ។)ការ fermentation ត្រូវបានអនុវត្តនៅ 30 ° C នៅក្នុងទីងងឹតរយៈពេល 14 ថ្ងៃ។សារធាតុ fermentation ត្រូវបានស្រង់ចេញជាមួយ EtOH 40 មីលីលីត្រ/ដប និង centrifuged (1500 ក្រាម, 4 ° C, 10 នាទី) ។អតិផរណាវប្បធម៌ (60 មីលីលីត្រ) ត្រូវបានស្រង់ចេញជាមួយនឹងល្បាយនៃ 10% MeOH/EtOAc ។ស្រទាប់សរីរាង្គត្រូវបានហួតក្រោមសម្ពាធកាត់បន្ថយ ដើម្បីទទួលបានសំណល់ (59.5 mg) ដែលត្រូវបានទទួលរងនូវ HPLC ជាមួយនឹងការផ្លាស់ប្តូរជម្រាល (0-10 នាទី: 90%) នៅលើជួរឈរដំណាក់កាលបញ្ច្រាស (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × ប្រវែង 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 នាទី: 90% H2O/CH3CN ទៅ 70% H2O/CH3CN (ជម្រាល), 35–45 នាទី: 90% H2O/EtOH, 45–155 នាទី: 90% H2O /EtOH ទៅ 100% EtOH (ជម្រាល (ជម្រាល), 155-200 នាទី: 100% EtOH) នៅអត្រាលំហូរ 1.5 មីលីលីត្រ / នាទី, coumamonamide (1, 36.0 មីលីក្រាម) ត្រូវបានញែកដាច់ពីគ្នាជាម្សៅអាម៉ូញាក់ពណ៌ស។
Kumamotoamide (1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H) ។), 4.08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+៖ [C6H9N2O2]+ តម្លៃគណនា៖ 141.0659, តម្លៃវាស់វែង៖ 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603–1593, 1537 សង់ទីម៉ែត្រ
គ្រាប់ពូជកូឡុំប៊ី (Col-0) ទទួលបានពីមជ្ឈមណ្ឌលធនធានជីវសាស្រ្ត Arabidopsis (ABRC) ដោយមានការអនុញ្ញាតសម្រាប់ការប្រើប្រាស់ស្រាវជ្រាវ។គ្រាប់ពូជ Col-0 ត្រូវបានបន្តពូជ និងថែរក្សានៅក្រោមលក្ខខណ្ឌមន្ទីរពិសោធន៍របស់យើង ហើយប្រើជារុក្ខជាតិ Arabidopsis ប្រភេទព្រៃ។គ្រាប់ពូជ Arabidopsis ត្រូវបានក្រៀវលើផ្ទៃ និងដាំដុះនៅក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុក Murashige និង Skoog ដែលមានកម្លាំង 2% ដែលមាន sucrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-morpholino) អាស៊ីត ethanesulfonic (MES) ( Fujifilm Wako Pure Chemical )) និង 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical) pH 5.7 នៅសីតុណ្ហភាព 23°C និងពន្លឺថេរ។គ្រាប់ពូជនៃ phs1-1 mutant ត្រូវបានផ្តល់ដោយ T. Hashimoto (វិទ្យាស្ថានវិទ្យាសាស្ត្រ និងបច្ចេកវិទ្យាណារ៉ា)។
គ្រាប់ពូជនៃសំពាធ SR-1 ត្រូវបានផ្តល់ដោយ T. Hashimoto (វិទ្យាស្ថានវិទ្យាសាស្ត្រ និងបច្ចេកវិទ្យាណារ៉ា) និងប្រើប្រាស់ជារុក្ខជាតិថ្នាំជក់ប្រភេទព្រៃ។គ្រាប់ពូជថ្នាំជក់ត្រូវបានក្រៀវលើផ្ទៃ ហើយត្រាំក្នុងទឹកមាប់មគរយៈពេលបីយប់ ដើម្បីជំរុញដំណុះ បន្ទាប់មកដាក់ក្នុងដំណោះស្រាយកម្លាំងពាក់កណ្តាលដែលមាន 2% sucrose, 0.05% (w/v) MES និង 0.8% gellan gum (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige ។និងមធ្យម Skoog) ជាមួយ pH 5.7 និង incubated នៅ 23 ° C នៅក្រោមពន្លឺថេរ។
Strain Tak-1 ត្រូវបានផ្តល់ដោយ T. Kohchi (សាកលវិទ្យាល័យ Kyoto) ហើយត្រូវបានគេប្រើជាអង្គភាពពិសោធន៍ស្តង់ដារសម្រាប់ការសិក្សាថ្លើម។Gemma ត្រូវបានទទួលបានពីរុក្ខជាតិដែលបានក្រៀវរួចហើយបន្ទាប់មកលាបលើឧបករណ៍ផ្ទុក Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) ដែលមានស្ករកៅស៊ូ 1% sucrose និង 0.3% gellan ហើយបានភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាព 23°C ក្រោមពន្លឺបន្តបន្ទាប់។
កោសិកាថ្នាំជក់ BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) ត្រូវបានផ្តល់ដោយ S. Hasezawa (សាកលវិទ្យាល័យតូក្យូ)។កោសិកា BY-2 ត្រូវបានពនឺ 95 ដងក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុក Linsmeier និង Skoog ដែលបានកែប្រែ ហើយត្រូវបានបន្ថែមប្រចាំសប្តាហ៍ជាមួយនឹងអាស៊ីត 2,4-dichlorophenoxyacetic 32 ។ការព្យួរកោសិកាត្រូវបានលាយបញ្ចូលគ្នានៅលើទឹកក្រឡុកនៅ 130 rpm នៅ 27 ° C នៅក្នុងទីងងឹត។លាងសម្អាតកោសិកាជាមួយនឹងបរិមាណ 10 ដងនៃមធ្យមស្រស់ ហើយផ្អាកម្តងទៀតក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុកដូចគ្នា។បន្ទាត់កោសិកាប្តូរហ្សែន BY-2 បង្ហាញស្ថេរភាពនូវសញ្ញាសម្គាល់មីក្រូ tubule TagRFP-TUA6 ឬសញ្ញាសម្គាល់សរសៃ actin GFP-ABD2 នៅក្រោមកម្មវិធីផ្សព្វផ្សាយនៃមេរោគផ្កាខាត់ណាខៀវ mosaic 35S ត្រូវបានបង្កើតដូចដែលបានពិពណ៌នា 33,34,35។បន្ទាត់ក្រឡាទាំងនេះអាចត្រូវបានរក្សាទុក និងធ្វើសមកាលកម្មដោយប្រើនីតិវិធីស្រដៀងនឹងខ្សែក្រឡាដែលប្រើសម្រាប់ខ្សែ BY-2 ដើម។
កោសិកា HeLa ត្រូវបានដាំដុះនៅក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុក Eagle (DMEM) (បច្ចេកវិទ្យាជីវិត) ដែលបានកែប្រែរបស់ Dulbecco (បច្ចេកវិទ្យាជីវិត) ដែលត្រូវបានបន្ថែមដោយសេរ៉ូមទារកក្នុងផ្ទៃ 10%, 1.2 U/ml penicillin និង 1.2 μg/ml streptomycin នៅក្នុង incubator 37°C ជាមួយនឹង 5% CO2។
ការពិសោធន៍ទាំងអស់ដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុងសាត្រាស្លឹករឹតនេះត្រូវបានអនុវត្តដោយអនុលោមតាមបទប្បញ្ញត្តិ និងការណែនាំអំពីសុវត្ថិភាពជីវសាស្ត្រជប៉ុន។
សមាសធាតុត្រូវបានរំលាយនៅក្នុង dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) ជាដំណោះស្រាយស្តុក និងត្រូវបានពនលាយក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុក MS សម្រាប់ Arabidopsis និងថ្នាំជក់ ឬឧបករណ៍ផ្ទុក Gamborg B5 សម្រាប់ថ្លើម។សម្រាប់ការវិភាគការទប់ស្កាត់ការលូតលាស់ឫស គ្រាប់ពូជច្រើនជាង 10 ក្នុងមួយចានត្រូវបានគេសាបព្រោះនៅលើឧបករណ៍ផ្ទុក agar ដែលមានសមាសធាតុដែលបានចង្អុលបង្ហាញ ឬ DMSO ។គ្រាប់ត្រូវបាន incubated នៅក្នុងបន្ទប់លូតលាស់រយៈពេល 7 ថ្ងៃ។សំណាបត្រូវបានថតរូបហើយប្រវែងនៃឫសត្រូវបានវាស់។សម្រាប់ការវិភាគដំណុះ Arabidopsis គ្រាប់ពូជចំនួន 48 ក្នុងមួយចានត្រូវបានគេសាបព្រោះនៅលើមធ្យម agar ដែលមានសមាសធាតុ 200 μM ឬ DMSO ។គ្រាប់ពូជ Arabidopsis ត្រូវបានដាំដុះនៅក្នុងបន្ទប់លូតលាស់ ហើយចំនួននៃសំណាបដំណុះត្រូវបានរាប់ 7 ថ្ងៃបន្ទាប់ពីដំណុះ (dag) ។សម្រាប់ការវិភាគដំណុះថ្នាំជក់ គ្រាប់ចំនួន 24 ក្នុងមួយចានត្រូវបានគេសាបព្រោះនៅលើមធ្យម agar ដែលមាន 200 μM KAND ឬ DMSO ។គ្រាប់ពូជថ្នាំជក់ត្រូវបានដាំដុះក្នុងបន្ទប់លូតលាស់ ហើយចំនួននៃសំណាបដំណុះត្រូវបានរាប់បន្ទាប់ពី 14 ថ្ងៃ។សម្រាប់ការវិភាគការទប់ស្កាត់ការលូតលាស់របស់ថ្លើម អំប្រ៊ីយ៉ុងចំនួន 9 ពីចាននីមួយៗត្រូវបានគេដាក់នៅលើឧបករណ៍ផ្ទុក agar ដែលមានកំហាប់នៃ KAND ឬ DMSO ហើយត្រូវបាន incubated នៅក្នុងបន្ទប់លូតលាស់រយៈពេល 14 ថ្ងៃ។
ប្រើសំណាបដែលមានស្នាមប្រឡាក់ 5 mg/ml propidium iodide (PI) ដើម្បីមើលរូបភាពរបស់ root meristem ។សញ្ញា PI ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញដោយមីក្រូទស្សន៍ហ្វ្លុយអូរីស ដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍ស្កែនឡាស៊ែរ confocal TCS SPE (Leica Microsystems)។
ស្នាមប្រឡាក់គីមីនៃឫសជាមួយ β-glucuronidase (GUS) ត្រូវបានអនុវត្តតាមពិធីការដែលបានពិពណ៌នាដោយ Malami និង Benfey36 ។សំណាបត្រូវបានជួសជុលក្នុងអាសេតូន 90% ពេញមួយយប់ ប្រឡាក់ដោយ 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid ក្នុង GUS buffer រយៈពេល 1 ម៉ោង ហើយដាក់ក្នុងដំណោះស្រាយ chloraldehyde hydrated ។(8 ក្រាម chloral hydrate, ទឹក 2 មីលីលីត្រ និង 1 មីលីលីត្រ glycerol) និងសង្កេតឃើញដោយការជ្រៀតជ្រែកតាមមីក្រូទស្សន៍កម្រិតពណ៌ដោយប្រើប្រាស់មីក្រូទស្សន៍ Axio Imager M1 (Carl Zeiss) ។
មុំឫសត្រូវបានវាស់លើសំណាបអាយុ 7 ថ្ងៃដែលដាំដុះនៅលើចានដាក់បញ្ឈរ។វាស់មុំនៃឫសពីទិសដៅនៃវ៉ិចទ័រទំនាញដូចបានរៀបរាប់ក្នុងជំហានទី 6 ។
ការរៀបចំនៃ microtubules cortical ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញដូចដែលបានពិពណ៌នាជាមួយនឹងការកែប្រែបន្តិចបន្តួចចំពោះពិធីការ 37 ។អង់ទីករប្រឆាំងβ-tubulin (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) និង Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) ត្រូវបានគេប្រើជាអង្គបដិប្រាណចម្បង និងបន្ទាប់បន្សំនៅកម្រិត 1:1000 និង 1:100 dilutions ។ រៀងៗខ្លួន។រូបភាពពន្លឺត្រូវបានទទួលដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍ស្កេនឡាស៊ែរ confocal TCS SPE (Leica Microsystems)។ទទួលបានរូបភាព Z-stack និងបង្កើតការព្យាករណ៍អាំងតង់ស៊ីតេអតិបរមាតាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិត។
ការវិភាគលើការរីកកោសិកា HeLa ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើឧបករណ៍រាប់កោសិកា 8 (Dojindo) យោងតាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិត។
ការលូតលាស់របស់ E. coli DH5α ត្រូវបានវិភាគដោយការវាស់ស្ទង់ដង់ស៊ីតេកោសិកាក្នុងវប្បធម៌ដោយប្រើ spectrophotometer នៅ 600 nm (OD600)។
អង្គការ cytoskeletal នៅក្នុងកោសិកាប្តូរហ្សែន BY-2 ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍ហ្វ្លុយអូរីសដែលបំពាក់ដោយឧបករណ៍ស្កែនប្រសព្វ CSU-X1 (Yokogawa) និងកាមេរ៉ា sCMOS (Zyla, Andor Technology) ។ដង់ស៊ីតេ cytoskeletal ត្រូវបានវាយតម្លៃដោយការវិភាគរូបភាព ដែលកំណត់ចំនួនភាគរយនៃភីកសែល cytoskeletal ក្នុងចំណោមភីកសែល cytoplasmic នៅក្នុងរូបភាពប្រសព្វដោយប្រើកម្មវិធី ImageJ ដូចដែលបានពិពណ៌នា 38,39 ។
ដើម្បីរកឱ្យឃើញការស្លាប់កោសិកានៅក្នុងកោសិកា BY-2, aliquot នៃការព្យួរកោសិកាត្រូវបាន incubated ជាមួយ 0.05% Evans ខៀវសម្រាប់រយៈពេល 10 នាទីនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ស្នាមប្រឡាក់ពណ៌ខៀវ Evans ជ្រើសរើសនៃកោសិកាដែលស្លាប់គឺអាស្រ័យលើការបញ្ចោញសារធាតុជ្រលក់ចេញពីកោសិកាដែលអាចសម្រេចបានដោយភ្នាសប្លាស្មាដែលនៅដដែល40។កោសិកាប្រឡាក់ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍ភ្លឺ (BX53, Olympus) ។
កោសិកា HeLa ត្រូវបានដាំដុះនៅក្នុង DMEM បន្ថែមជាមួយនឹង 10% FBS នៅក្នុង incubator សើមនៅ 37 ° C និង 5% CO2 ។កោសិកាត្រូវបានព្យាបាលដោយ 100 μM KAND 11, អាស៊ីត kumamonamic 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco) ឬ 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) រយៈពេល 6 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 37 អង្សាសេ។កោសិកាត្រូវបានជួសជុលជាមួយនឹង MetOH រយៈពេល 10 នាទី ហើយបន្ទាប់មកជាមួយ acetate រយៈពេល 5 នាទីនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។កោសិកាថេរត្រូវបាន incubated ជាមួយ β-tubulin primary antibody (1D4A4, Proteintech: 66240-1) diluted in 0.5% BSA/PBS រយៈពេល 2 ម៉ោង លាង 3 ដងជាមួយ TBST ហើយបន្ទាប់មក incubated ជាមួយ Alexa Fluor goat antibody ។៤៨៨ ១ ម៉ោង។- Mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) និង 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ពនឺក្នុង 0.5% BSA/PBS ។បន្ទាប់ពីលាងសម្អាតជាមួយ TBST បីដង កោសិកាប្រឡាក់ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅលើមីក្រូទស្សន៍ Nikon Eclipse Ti-E បញ្ច្រាស។រូបភាពត្រូវបានថតជាមួយនឹងកាមេរ៉ា Hamamatsu ORCA-R2 CCD ត្រជាក់ដោយប្រើកម្មវិធី MetaMorph (ឧបករណ៍ម៉ូលេគុល)។
ពេលវេលាផ្សាយ៖ មិថុនា-១៧-២០២៤