សូមអរគុណសម្រាប់ការចូលមើលគេហទំព័រ Nature.com។ កំណែកម្មវិធីរុករកដែលអ្នកកំពុងប្រើមានការគាំទ្រ CSS មានកំណត់។ ដើម្បីទទួលបានលទ្ធផលល្អបំផុត យើងសូមណែនាំឱ្យអ្នកប្រើកំណែថ្មីជាងនៃកម្មវិធីរុករករបស់អ្នក (ឬបិទរបៀបឆបគ្នានៅក្នុង Internet Explorer)។ ទន្ទឹមនឹងនេះ ដើម្បីធានាបាននូវការគាំទ្រជាបន្តបន្ទាប់ យើងកំពុងបង្ហាញគេហទំព័រដោយមិនចាំបាច់រចនាបថ ឬ JavaScript ទេ។
ការរកឃើញ និងការប្រើប្រាស់ផលិតផលធម្មជាតិប្រកបដោយប្រយោជន៍អាចជួយកែលម្អជីវិតមនុស្ស។ សារធាតុគីមីរារាំងការលូតលាស់របស់រុក្ខជាតិត្រូវបានគេប្រើប្រាស់យ៉ាងទូលំទូលាយជាថ្នាំសម្លាប់ស្មៅដើម្បីគ្រប់គ្រងស្មៅ។ ដោយសារតែតម្រូវការក្នុងការប្រើប្រាស់ថ្នាំសម្លាប់ស្មៅប្រភេទផ្សេងៗគ្នា មានតម្រូវការក្នុងការកំណត់អត្តសញ្ញាណសមាសធាតុដែលមានយន្តការសកម្មភាពថ្មី។ នៅក្នុងការសិក្សានេះ យើងបានរកឃើញសមាសធាតុ N-alkoxypyrrole ថ្មីមួយគឺ coumamonamide ពី Streptomyces werraensis MK493-CF1 ហើយបានបង្កើតដំណើរការសំយោគពេញលេញ។ តាមរយៈការវាស់វែងសកម្មភាពជីវសាស្រ្ត យើងបានរកឃើញថាអាស៊ីត urs-monoamic គឺជាសារធាតុសំយោគកម្រិតមធ្យមនៃ urs-monoamide និងជាសក្តានុពលមួយ...ថ្នាំទប់ស្កាត់ការលូតលាស់របស់រុក្ខជាតិលើសពីនេះ យើងបានបង្កើតដេរីវេអាស៊ីត urbenonic ជាច្រើនប្រភេទ រួមទាំងដេរីវេ urbenyloxy (UDA) ដែលមានសកម្មភាពសម្លាប់ស្មៅខ្ពស់ដោយមិនប៉ះពាល់អវិជ្ជមានដល់ការលូតលាស់កោសិកា HeLa។ យើងក៏បានរកឃើញផងដែរថា ដេរីវេអាស៊ីត urmotonic រំខានដល់មីក្រូទូប៊ុលរុក្ខជាតិ។ លើសពីនេះ KAND ប៉ះពាល់ដល់សរសៃអាកទីន និងបង្កឱ្យមានការស្លាប់កោសិកា។ ផលប៉ះពាល់ចម្រុះទាំងនេះខុសពីផលប៉ះពាល់នៃថ្នាំទប់ស្កាត់មីក្រូទូប៊ុលដែលគេស្គាល់ ហើយបង្ហាញពីយន្តការថ្មីនៃសកម្មភាពសម្រាប់អាស៊ីត ursonic ដែលតំណាងឱ្យគុណសម្បត្តិសំខាន់មួយក្នុងការអភិវឌ្ឍថ្នាំសម្លាប់ស្មៅថ្មី។
ការរកឃើញ និងការអនុវត្តជាក់ស្តែងនៃផលិតផលធម្មជាតិដែលមានប្រយោជន៍ និងនិស្សន្ទវត្ថុរបស់វា គឺជាមធ្យោបាយមួយដើម្បីកែលម្អគុណភាពជីវិតមនុស្ស។ សារធាតុរំលាយអាហារបន្ទាប់បន្សំដែលផលិតដោយអតិសុខុមប្រាណ រុក្ខជាតិ និងសត្វល្អិត បាននាំឱ្យមានការរីកចម្រើនដ៏សំខាន់ក្នុងវិស័យវេជ្ជសាស្ត្រ និងកសិកម្ម។ ថ្នាំអង់ទីប៊ីយោទិច និងថ្នាំប្រឆាំងនឹងជំងឺមហារីកឈាមជាច្រើនត្រូវបានបង្កើតឡើងពីផលិតផលធម្មជាតិ។ លើសពីនេះ ប្រភេទផ្សេងៗនៃថ្នាំសម្លាប់សត្វល្អិតថ្នាំសម្លាប់ផ្សិត និងថ្នាំសម្លាប់ស្មៅត្រូវបានស្រង់ចេញពីផលិតផលធម្មជាតិទាំងនេះសម្រាប់ប្រើប្រាស់ក្នុងវិស័យកសិកម្ម។ ជាពិសេស ថ្នាំសម្លាប់ស្មៅគ្រប់គ្រងស្មៅគឺជាឧបករណ៍សំខាន់សម្រាប់បង្កើនទិន្នផលដំណាំក្នុងវិស័យកសិកម្មទំនើប ហើយសមាសធាតុជាច្រើនប្រភេទត្រូវបានប្រើប្រាស់ជាលក្ខណៈពាណិជ្ជកម្មរួចហើយ។ ដំណើរការកោសិកាជាច្រើននៅក្នុងរុក្ខជាតិ ដូចជារស្មីសំយោគ ការរំលាយអាហារអាស៊ីតអាមីណូ ការសំយោគជញ្ជាំងកោសិកា បទប្បញ្ញត្តិនៃមីតូស៊ីស ការបញ្ជូនសញ្ញាអរម៉ូនរុក្ខជាតិ ឬការសំយោគប្រូតេអ៊ីន ត្រូវបានចាត់ទុកថាជាគោលដៅធម្មតានៃថ្នាំសម្លាប់ស្មៅ។ សមាសធាតុដែលរារាំងមុខងារមីក្រូទូប៊ុល គឺជាថ្នាក់ទូទៅនៃថ្នាំសម្លាប់ស្មៅដែលប៉ះពាល់ដល់ការលូតលាស់របស់រុក្ខជាតិដោយប៉ះពាល់ដល់បទប្បញ្ញត្តិមីតូស៊ីត។
មីក្រូទូប៊ុល គឺជាសមាសធាតុនៃគ្រោងឆ្អឹងស៊ីតូកូល ហើយត្រូវបានរក្សាទុកយ៉ាងទូលំទូលាយនៅក្នុងកោសិកាយូការីយ៉ូត។ ហេតេរ៉ូឌីមឺរទូប៊ុល មាន α-ទូប៊ុល និង β-ទូប៊ុល បង្កើតជាប្រូតូហ្វីឡាម៉ង់មីក្រូទូប៊ុលលីនេអ៊ែរ ដោយមានប្រូតូហ្វីឡាម៉ង់ចំនួន 13 បង្កើតជារចនាសម្ព័ន្ធស៊ីឡាំង។ មីក្រូទូប៊ុលដើរតួនាទីច្រើននៅក្នុងកោសិការុក្ខជាតិ រួមទាំងការកំណត់រូបរាងកោសិកា ការបែងចែកកោសិកា និងការដឹកជញ្ជូនក្នុងកោសិកា3,4។ កោសិការុក្ខជាតិមានមីក្រូទូប៊ុលនៅក្រោមភ្នាសប្លាស្មាអន្តរដំណាក់កាល ហើយមីក្រូទូប៊ុលប្រភេទ cortical ទាំងនេះត្រូវបានគេគិតថាគ្រប់គ្រងការរៀបចំមីក្រូហ្វីប្រីលសែលុយឡូសតាមរយៈការគ្រប់គ្រងស្មុគស្មាញសំយោគសែលុយឡូស4,5។ មីក្រូទូប៊ុលប្រភេទ Cortical នៃកោសិកាអេពីឌែមឫស ដែលមានវត្តមាននៅក្នុងតំបន់នៃការលាតសន្ធឹងយ៉ាងលឿននៃចុងឫស មានទីតាំងនៅចំហៀង ហើយមីក្រូហ្វាយប័រសែលុយឡូសដើរតាមមីក្រូទូប៊ុលទាំងនេះ និងកំណត់ទិសដៅនៃការពង្រីកកោសិកា ដោយហេតុនេះជំរុញការលាតសន្ធឹងកោសិកាអានីសូត្រូពិច។ ដូច្នេះ មុខងារមីក្រូទូប៊ុលមានទំនាក់ទំនងយ៉ាងជិតស្និទ្ធទៅនឹងរូបរាងរុក្ខជាតិ។ ការជំនួសអាស៊ីតអាមីណូនៅក្នុងហ្សែនដែលអ៊ិនកូដ tubulin បណ្តាលឱ្យមានលំអៀងនៃអារេ microtubule cortical និងការលូតលាស់ផ្នែកខាងឆ្វេង ឬខាងស្តាំនៅក្នុង Arabidopsis 6,7។ ស្រដៀងគ្នានេះដែរ ការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុងប្រូតេអ៊ីនដែលទាក់ទងនឹង microtubule ដែលគ្រប់គ្រងឌីណាមិក microtubule ក៏អាចនាំឱ្យមានការលូតលាស់ឫសដែលបង្ខូចទ្រង់ទ្រាយ8,9,10,11,12,13។ លើសពីនេះ ការព្យាបាលដោយថ្នាំសម្លាប់ស្មៅដែលរំខានដល់ microtubule ដូចជា disopyramide ដែលត្រូវបានគេស្គាល់ផងដែរថាជា pretilachlor ក៏បណ្តាលឱ្យមានការលូតលាស់ឫស oblique ផ្នែកខាងឆ្វេង14។ ទិន្នន័យទាំងនេះបង្ហាញថា ការគ្រប់គ្រងច្បាស់លាស់នៃមុខងារ microtubule គឺមានសារៈសំខាន់សម្រាប់កំណត់ទិសដៅនៃការលូតលាស់របស់រុក្ខជាតិ។
ថ្នាំទប់ស្កាត់មីក្រូទូប៊ុលប្រភេទផ្សេងៗគ្នាត្រូវបានគេរកឃើញ ហើយថ្នាំទាំងនេះបានរួមចំណែកយ៉ាងសំខាន់ដល់ការស្រាវជ្រាវគ្រោងឆ្អឹងកោសិកា ក៏ដូចជាវិស័យកសិកម្ម និងវេជ្ជសាស្ត្រ។ ជាពិសេស អូរីហ្សាលីន សមាសធាតុឌីនីត្រូអានីលីន ឌីសូភីរ៉ាមីត សមាសធាតុទាក់ទងនឹងប៊ែនហ្សាមីត និងសារធាតុស្រដៀងគ្នារបស់វា អាចរារាំងមុខងារមីក្រូទូប៊ុល ហើយដោយហេតុនេះរារាំងការលូតលាស់របស់រុក្ខជាតិ។ ដូច្នេះ ពួកវាត្រូវបានគេប្រើយ៉ាងទូលំទូលាយជាថ្នាំសម្លាប់ស្មៅ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ដោយសារមីក្រូទូប៊ុលគឺជាសមាសធាតុសំខាន់មួយនៃកោសិការុក្ខជាតិ និងកោសិកាសត្វ ថ្នាំទប់ស្កាត់មីក្រូទូប៊ុលភាគច្រើនមានជាតិពុលកោសិកាចំពោះកោសិកាទាំងពីរប្រភេទ។ ដូច្នេះ ទោះបីជាពួកវាមានប្រយោជន៍ដែលត្រូវបានទទួលស្គាល់ថាជាថ្នាំសម្លាប់ស្មៅក៏ដោយ ភ្នាក់ងារប្រឆាំងមីក្រូទូប៊ុលមួយចំនួនមានកំណត់ត្រូវបានប្រើសម្រាប់គោលបំណងជាក់ស្តែង។
Streptomyces គឺជាពពួកបាក់តេរីមួយប្រភេទនៃគ្រួសារ Streptomyces ដែលរួមមានបាក់តេរីក្រាមវិជ្ជមាន បាក់តេរីសរសៃ និងត្រូវបានគេស្គាល់យ៉ាងទូលំទូលាយសម្រាប់សមត្ថភាពរបស់វាក្នុងការផលិតសារធាតុរំលាយអាហារបន្ទាប់បន្សំជាច្រើនប្រភេទ។ ដូច្នេះវាត្រូវបានចាត់ទុកថាជាប្រភពដ៏សំខាន់បំផុតមួយនៃផលិតផលធម្មជាតិសកម្មជីវសាស្រ្តថ្មី។ នៅក្នុងការសិក្សាបច្ចុប្បន្ននេះ យើងបានរកឃើញសមាសធាតុថ្មីមួយហៅថា coumamonamide ដែលត្រូវបានញែកចេញពី Streptomyces werraensis MK493-CF1 និង S. werraensis ISP 5486។ ដោយប្រើការវិភាគវិសាលគម និងការវិភាគវិសាលគមពេញលេញ រចនាសម្ព័ន្ធរបស់ coumamonamide ត្រូវបានកំណត់លក្ខណៈ ហើយគ្រោងឆ្អឹង N-alkoxypyrrole តែមួយគត់របស់វាត្រូវបានកំណត់។ អាស៊ីត Ursmonic ដែលជាសារធាតុសំយោគកម្រិតមធ្យមនៃ ursmonoamide និងដេរីវេរបស់វា ត្រូវបានគេរកឃើញថារារាំងការលូតលាស់ និងដំណុះនៃរុក្ខជាតិគំរូដ៏ពេញនិយម Arabidopsis thaliana។ នៅក្នុងការសិក្សាអំពីទំនាក់ទំនងរចនាសម្ព័ន្ធ-សកម្មភាព យើងបានរកឃើញថាសមាសធាតុដែលមាន C9 ដែលត្រូវបានកែប្រែទៅជាអាស៊ីត ursonic ដែលហៅថាដេរីវេ nonyloxy នៃអាស៊ីត ursonic (KAND) បង្កើនប្រសិទ្ធភាពរារាំងយ៉ាងខ្លាំងលើការលូតលាស់ និងដំណុះ។ ជាពិសេស សារធាតុទប់ស្កាត់ការលូតលាស់របស់រុក្ខជាតិដែលទើបរកឃើញថ្មីក៏បានប៉ះពាល់ដល់ការលូតលាស់របស់ថ្នាំជក់ និងថ្លើមសត្វ ហើយមិនមានជាតិពុលដល់បាក់តេរី ឬកោសិកា HeLa ទេ។ លើសពីនេះ សារធាតុចម្រាញ់ពីអាស៊ីត urmotonic មួយចំនួនបង្កឱ្យមានរូបរាងឫសដែលខូចទ្រង់ទ្រាយ ដែលបញ្ជាក់ថាសារធាតុចម្រាញ់ទាំងនេះប៉ះពាល់ដោយផ្ទាល់ ឬដោយប្រយោលដល់មីក្រូទូប៊ុល។ ស្របនឹងគំនិតនេះ ការសង្កេតរបស់យើងលើមីក្រូទូប៊ុលដែលមានស្លាកសញ្ញា immunohistochemically ឬជាមួយប្រូតេអ៊ីន fluorescent បង្ហាញថាការព្យាបាលដោយ KAND ធ្វើឱ្យមីក្រូទូប៊ុលចុះខ្សោយ។ លើសពីនេះ ការព្យាបាលជាមួយនឹងសារធាតុចម្រាញ់ពីអាស៊ីត kumamotonic បានរំខានដល់មីក្រូហ្វីឡាម៉ង់អាកទីន។ ដូច្នេះ យើងបានរកឃើញសារធាតុទប់ស្កាត់ការលូតលាស់របស់រុក្ខជាតិថ្មីមួយប្រភេទដែលយន្តការនៃសកម្មភាពតែមួយគត់របស់វាពាក់ព័ន្ធនឹងការបំផ្លាញគ្រោងឆ្អឹងកោសិកា។
ពូជ MK493-CF1 ត្រូវបានញែកចេញពីដីនៅ Shinagawa-ku ទីក្រុងតូក្យូ។ ពូជ MK493-CF1 បានបង្កើតជាមីសេលីញ៉ូមស្ត្រូម៉ាលដែលមានមែកល្អ។ លំដាប់ដោយផ្នែកនៃហ្សែន RNA រីបូសូម 16S (1422 bp) ត្រូវបានកំណត់។ ពូជនេះគឺស្រដៀងគ្នាខ្លាំងណាស់ទៅនឹង S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: ពូជធម្មតា, 99.93%)។ ដោយផ្អែកលើលទ្ធផលនេះ វាត្រូវបានកំណត់ថា ពូជនេះមានទំនាក់ទំនងយ៉ាងជិតស្និទ្ធទៅនឹងពូជប្រភេទ S. werraensis។ ដូច្នេះ យើងបានដាក់ឈ្មោះពូជនេះជាបណ្ដោះអាសន្នថា S. werraensis MK493-CF1។ S. werraensis ISP 5486T ក៏ផលិតសមាសធាតុជីវសកម្មដូចគ្នាផងដែរ។ ដោយសារតែមានការស្រាវជ្រាវដំបូងតិចតួចក្នុងការទទួលបានផលិតផលធម្មជាតិពីអតិសុខុមប្រាណនេះ ការស្រាវជ្រាវគីមីបន្ថែមត្រូវបានអនុវត្ត។ បន្ទាប់ពីការដាំដុះ S. werraensis MK493-CF1 លើឧបករណ៍ផ្ទុកស្រូវសាលីដោយដំណើរការ fermentation រឹងនៅសីតុណ្ហភាព 30°C រយៈពេល 14 ថ្ងៃ ឧបករណ៍ផ្ទុកត្រូវបានស្រង់ចេញជាមួយ EtOH 50%។ សំណាក 60 មីលីលីត្រត្រូវបានសម្ងួតដើម្បីទទួលបានសារធាតុចម្រាញ់ឆៅ 59.5 មីលីក្រាម។ សារធាតុចម្រាញ់ឆៅត្រូវបានទទួលរងនូវ HPLC ដំណាក់កាលបញ្ច្រាសដើម្បីផ្តល់ N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1 ដែលមានឈ្មោះថា coumamonamide 36.0 មីលីក្រាម)។ បរិមាណសរុបនៃ 1 គឺប្រហែល 60% នៃសារធាតុចម្រាញ់ឆៅ។ ដូច្នេះ យើងបានសម្រេចចិត្តសិក្សាលម្អិតអំពីលក្ខណៈសម្បត្តិរបស់ kumamotoamide 1។
Coumamonamide 1 គឺជាម្សៅអាម៉ូហ្វូសពណ៌ស និងវិសាលគមម៉ាសដែលមានគុណភាពបង្ហាញខ្ពស់ (HRESIMS) បញ្ជាក់ C6H8N2O2 (រូបភាពទី 1)។ បំណែក pyrrole ជំនួស C2 នៃសមាសធាតុនេះត្រូវបានកំណត់លក្ខណៈដោយ δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH ក្នុងវិសាលគម NMR 1H: 4.5 Hz, H-5) និង δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) ហើយវិសាលគម NMR 13C បង្ហាញពីវត្តមាននៃអាតូមកាបូន sp2 ចំនួនបួន។ វត្តមាននៃក្រុមអាមីតនៅទីតាំង C2 ត្រូវបានវាយតម្លៃដោយទំនាក់ទំនង HMBC ពីប្រូតុង C-3 ទៅកាបូនអាមីតកាបូននីលនៅ δC 161.1។ លើសពីនេះ កំពូល NMR 1 H និង 13 C នៅ δH 4.10 (3H, S) និង δC 68.3 បង្ហាញពីវត្តមាននៃក្រុម N-មេតូស៊ីនៅក្នុងម៉ូលេគុល។ ទោះបីជាទីតាំងត្រឹមត្រូវនៃក្រុមមេតូស៊ីមិនទាន់ត្រូវបានកំណត់ដោយប្រើការវិភាគវិសាលគមដូចជាវិសាលគមភាពខុសគ្នាដែលប្រសើរឡើង និងអក្សរកាត់អូវើរហឺរនុយក្លេអ៊ែរ (NOEDF) ក៏ដោយ N-មេតូស៊ី-1H-pyrrole-2-carboxamide បានក្លាយជាសមាសធាតុបេក្ខជនដំបូង។
ដើម្បីកំណត់រចនាសម្ព័ន្ធត្រឹមត្រូវនៃ 1 ការសំយោគសរុបត្រូវបានអនុវត្ត (រូបភាពទី 2a)។ ការព្យាបាល 2-អាមីណូភីរីឌីន 2 ដែលមានលក់នៅលើទីផ្សារជាមួយ m-CPBA បាននាំឱ្យមាន N-អុកស៊ីដ 3 ដែលត្រូវគ្នាក្នុងទិន្នផលបរិមាណ។ បន្ទាប់ពី 2-អាមីណូអាហ្សីដេតនៃ 2 ប្រតិកម្មស៊ីក្លូខនដេសស្យុងដែលបានពិពណ៌នាដោយ Abramovich ត្រូវបានអនុវត្តនៅក្នុង benzene នៅ 90°C ដើម្បីទទួលបាន 1-អ៊ីដ្រូស៊ី-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 ដែលចង់បានជាក្រាម។ ល្បឿន 60% (ពីរដំណាក់កាល)។ 15,16។ មេទីលឡាស្យុង និងអ៊ីដ្រូលីសនៃ 4 បន្ទាប់មកបានផ្តល់ឱ្យ 1-មេតូស៊ី-1H-pyrrole-2-carboxylic acid (ហៅថា "cumotonic acid", 6) ក្នុងទិន្នផលល្អ (70%, ពីរជំហាន)។ ជាចុងក្រោយ ការបន្សាបអាស៊ីតតាមរយៈអាស៊ីតក្លរួកម្រិតមធ្យម 6 ដោយប្រើអាម៉ូញាក់ទឹកបានផ្តល់ឱ្យ Kumamoto amide 1 ក្នុងទិន្នផល 98%។ ទិន្នន័យវិសាលគមទាំងអស់នៃសំយោគ 1 គឺស្រដៀងគ្នាទៅនឹង 1 ដាច់ដោយឡែក ដូច្នេះរចនាសម្ព័ន្ធនៃ 1 ត្រូវបានកំណត់;
ការសំយោគទូទៅ និងការវិភាគសកម្មភាពជីវសាស្រ្តរបស់ urbenamide និង urbenic acid។ (ក) ការសំយោគសរុបនៃ Kumamoto amide។ (ខ) សំណាប Arabidopsis Columbia (Col) ប្រភេទព្រៃអាយុប្រាំពីរថ្ងៃ ត្រូវបានដាំដុះនៅលើចាន Murashige និង Skoog (MS) ដែលមាន coumamonamide 6 ឬ coumamonamide 1 នៅកំហាប់ដែលបានចង្អុលបង្ហាញ។ របារមាត្រដ្ឋាន = 1 សង់ទីម៉ែត្រ។
ដំបូង យើងបានវាយតម្លៃសកម្មភាពជីវសាស្រ្តរបស់ urbenamide និងសមាសធាតុមធ្យមរបស់វាសម្រាប់សមត្ថភាពរបស់វាក្នុងការកែប្រែការលូតលាស់របស់រុក្ខជាតិ។ យើងបានបន្ថែមកំហាប់ផ្សេងៗនៃ ursmonamide 1 ឬ ursmonic acid 6 ទៅក្នុងសារធាតុ MS agar medium ហើយបានដាំដុះសំណាប Arabidopsis thaliana នៅលើសារធាតុនេះ។ ការវិភាគទាំងនេះបានបង្ហាញថាកំហាប់ខ្ពស់ (500 μM) នៃ 6 បានរារាំងការលូតលាស់របស់ឫស (រូបភាពទី 2b)។ បន្ទាប់មក យើងបានបង្កើតដេរីវេផ្សេងៗដោយជំនួសទីតាំង N1 នៃ 6 ហើយបានធ្វើការសិក្សាទំនាក់ទំនងរចនាសម្ព័ន្ធ-សកម្មភាពលើពួកវា (ដំណើរការសំយោគអាណាឡូកត្រូវបានពិពណ៌នានៅក្នុងព័ត៌មានជំនួយ (SI))។ សំណាប Arabidopsis ត្រូវបានដាំដុះនៅលើសារធាតុដែលមានដេរីវេអាស៊ីត ursonic 50 μM ហើយប្រវែងឫសត្រូវបានវាស់វែង។ ដូចដែលបានបង្ហាញនៅលើរូបភាព។ ដូចបង្ហាញក្នុងរូបភាពទី 3a, b និង S1 អាស៊ីត coumamo មានប្រវែងខុសៗគ្នានៃខ្សែសង្វាក់អាល់កូស៊ីលីនេអ៊ែរ (9, 10, 11, 12, និង 13) ឬខ្សែសង្វាក់អាល់កូស៊ីធំ (15, 16, និង 17) នៅទីតាំង N1។ ដេរីវេបានបង្ហាញពីការរារាំងយ៉ាងសំខាន់នៃការលូតលាស់របស់ឫស។ លើសពីនេះ យើងបានរកឃើញថា ការប្រើប្រាស់ 200 μM 10, 11 ឬ 17 បានរារាំងដំណុះ (រូបភាពទី 3c និង S2)។
ការសិក្សាអំពីទំនាក់ទំនងរចនាសម្ព័ន្ធ-សកម្មភាពនៃអាមីត Kumamoto និងសមាសធាតុពាក់ព័ន្ធ។ (ក) រចនាសម្ព័ន្ធ និងគ្រោងការណ៍សំយោគនៃអាណាឡូក។ (ខ) ការវាស់បរិមាណប្រវែងឫសនៃសំណាបអាយុ 7 ថ្ងៃដែលដាំដុះលើឧបករណ៍ផ្សព្វផ្សាយ MS ដែលមាន ឬគ្មានដេរីវេ coumamonamide 50 μM។ សញ្ញាផ្កាយបង្ហាញពីភាពខុសគ្នាគួរឱ្យកត់សម្គាល់ជាមួយនឹងការព្យាបាលដោយការក្លែងបន្លំ (t test, p< ០.០៥)។ n>១៨. ទិន្នន័យត្រូវបានបង្ហាញជាមធ្យម ± SD។ nt មានន័យថា "មិនបានសាកល្បង" ពីព្រោះគ្រាប់ពូជជាង 50% មិនដុះពន្លក។ (គ) ការវាស់បរិមាណអត្រាដំណុះនៃគ្រាប់ពូជដែលបានព្យាបាលដែលត្រូវបានភ្ញាស់រយៈពេល 7 ថ្ងៃនៅក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុក MS ជាមួយ ឬគ្មាន coumamonamide 200 μM និងសមាសធាតុពាក់ព័ន្ធ។ សញ្ញាផ្កាយបង្ហាញពីភាពខុសគ្នាគួរឱ្យកត់សម្គាល់ជាមួយនឹងការព្យាបាលក្លែងក្លាយ (ការធ្វើតេស្ត chi-square)។ n=96។
គួរឱ្យចាប់អារម្មណ៍ ការបន្ថែមខ្សែសង្វាក់ចំហៀងអាល់គីលដែលវែងជាង C9 បានកាត់បន្ថយសកម្មភាពរារាំង ដែលបង្ហាញថាសមាសធាតុទាក់ទងនឹងអាស៊ីតគូម៉ាម៉ូតូទិកតម្រូវឱ្យមានខ្សែសង្វាក់ចំហៀងដែលមានទំហំជាក់លាក់មួយដើម្បីបង្ហាញសកម្មភាពជីវសាស្រ្តរបស់វា។
ដោយសារតែការវិភាគទំនាក់ទំនងរចនាសម្ព័ន្ធ-សកម្មភាពបានបង្ហាញថា C9 ត្រូវបានកែប្រែទៅជាអាស៊ីត ursonic ហើយដេរីវេ nonyloxy នៃអាស៊ីត ursonic (តទៅនេះហៅថា KAND 11) គឺជាសារធាតុទប់ស្កាត់ការលូតលាស់របស់រុក្ខជាតិដែលមានប្រសិទ្ធភាពបំផុត យើងបានធ្វើការកំណត់លក្ខណៈលម្អិតបន្ថែមទៀតនៃ KAND 11។ ការព្យាបាល Arabidopsis ជាមួយ KAND 11 កំហាប់ 50 μM ស្ទើរតែការពារដំណុះទាំងស្រុង ខណៈពេលដែលកំហាប់ទាប (40, 30, 20, ឬ 10 μM) នៃ KAND 11 បានរារាំងការលូតលាស់របស់ឫសតាមរបៀបអាស្រ័យលើកម្រិតថ្នាំ (រូបភាពទី 4a, b)។ ដើម្បីសាកល្បងថាតើ KAND 11 ប៉ះពាល់ដល់លទ្ធភាពរស់រានមានជីវិតរបស់មេរីស្ទេមឫសឬអត់ យើងបានពិនិត្យមើលមេរីស្ទេមឫសដែលប្រឡាក់ដោយ propidium iodide (PI) ហើយវាស់ទំហំផ្ទៃមេរីស្ទេម។ ទំហំនៃមេរីស្ទេមរបស់សំណាបដែលដាំដុះលើឧបករណ៍ផ្ទុកដែលមាន KAND-11 25 μM គឺ 151.1 ± 32.5 μm ខណៈពេលដែលទំហំនៃមេរីស្ទេមរបស់សំណាបដែលដាំដុះលើឧបករណ៍ផ្ទុកត្រួតពិនិត្យដែលមាន DMSO គឺ 264.7 ± 30.8 μm (រូបភាពទី 4c, d) ដែលបង្ហាញថា KAND-11 ស្តារសកម្មភាពកោសិកាឡើងវិញ។ ការរីករាលដាល។ មេរីស្ទេមឫស។ ស្របនឹងរឿងនេះ ការព្យាបាលដោយ KAND 11 បានកាត់បន្ថយបរិមាណសញ្ញាសម្គាល់ការបែងចែកកោសិកា CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS នៅក្នុងមេរីស្ទេមឫស (រូបភាពទី 4e) 17។ លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថា KAND 11 រារាំងការលូតលាស់របស់ឫសដោយកាត់បន្ថយសកម្មភាពរីកសាយកោសិកា។
ការវិភាគអំពីឥទ្ធិពលរារាំងនៃដេរីវេអាស៊ីត urbenonic (ដេរីវេ urbenyloxy) ទៅលើការលូតលាស់។ (ក) សំណាប Col ប្រភេទព្រៃអាយុ 7 ថ្ងៃដែលដាំដុះលើបន្ទះ MS ជាមួយនឹងកំហាប់ដែលបានចង្អុលបង្ហាញនៃ KAND 11។ របារមាត្រដ្ឋាន = 1 សង់ទីម៉ែត្រ។ (ខ) ការវាស់បរិមាណប្រវែងឫស។ អក្សរបង្ហាញពីភាពខុសគ្នាគួរឱ្យកត់សម្គាល់ (ការធ្វើតេស្ត Tukey HSD, ទំព័រ< ០.០៥)។ n>១៦. ទិន្នន័យត្រូវបានបង្ហាញជាមធ្យម ± SD។ (គ) មីក្រូទស្សន៍ខនហ្វូកាល់នៃឫស Col ប្រភេទព្រៃដែលលាបពណ៌ដោយ propidium iodide ដែលដាំដុះនៅលើបន្ទះ MS ដែលមាន ឬគ្មាន 25 μM KAND 11។ វង់ក្រចកពណ៌សបង្ហាញពីមេរីស្ទេមឫស។ របារមាត្រដ្ឋាន = 100 µm។ (ឃ) ការវាស់បរិមាណទំហំមេរីស្ទេមឫស (n = 10 ដល់ 11)។ ភាពខុសគ្នាខាងស្ថិតិត្រូវបានកំណត់ដោយប្រើ t-test (p< 0.05)។ របារតំណាងឱ្យទំហំមេរីស្តេមជាមធ្យម។ (ង) មីក្រូទស្សន៍ឌីផេរ៉ង់ស្យែលផ្ទុយស្រឡះ (DIC) នៃមេរីស្តេមឫសដែលមានរចនាសម្ព័ន្ធ CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS ត្រូវបានប្រឡាក់ពណ៌ និងប្រឡាក់ពណ៌លើសំណាបអាយុ 5 ថ្ងៃដែលដាំដុះលើចាន MS ដែលមាន ឬគ្មានការវិភាគ KAND 25 µM។
ភាពពុលរុក្ខជាតិរបស់ KAND 11 ត្រូវបានសាកល្បងបន្ថែមទៀតដោយប្រើរុក្ខជាតិពីរស្លឹកមួយទៀតគឺថ្នាំជក់ (Nicotiana tabacum) និងសារពាង្គកាយគំរូរុក្ខជាតិដីដ៏សំខាន់មួយគឺ liverwort (Marchantia polymorpha)។ ដូចករណី Arabidopsis សំណាបថ្នាំជក់ SR-1 ដែលដាំដុះលើឧបករណ៍ផ្ទុកដែលមាន KAND 11 កំហាប់ 25 μM បានបង្កើតឫសខ្លីជាង (រូបភាពទី 5a)។ លើសពីនេះ គ្រាប់ពូជចំនួន 40 ក្នុងចំណោម 48 គ្រាប់បានដុះពន្លកលើចានដែលមាន KAND 11 កំហាប់ 200 μM ខណៈដែលគ្រាប់ពូជទាំង 48 គ្រាប់បានដុះពន្លកលើឧបករណ៍ផ្ទុកដែលបានព្យាបាលដោយបច្ចេកទេសក្លែងក្លាយ ដែលបង្ហាញថាកំហាប់ KAND ខ្ពស់គឺមានសារៈសំខាន់ (p< 0.05; chi test -square) បានរារាំងដំណុះនៃថ្នាំជក់។ (រូបភាពទី 5b)។ លើសពីនេះ កំហាប់ KAND 11 ដែលរារាំងការលូតលាស់របស់បាក់តេរីនៅក្នុង liverwort គឺស្រដៀងគ្នាទៅនឹងកំហាប់ដែលមានប្រសិទ្ធភាពនៅក្នុង Arabidopsis (រូបភាពទី 5c)។ លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថា KAND 11 អាចរារាំងការលូតលាស់របស់រុក្ខជាតិជាច្រើនប្រភេទ។ បន្ទាប់មកយើងបានស៊ើបអង្កេតពីភាពពុលកោសិកាដែលអាចកើតមាននៃសមាសធាតុដែលទាក់ទងនឹង monoamide ខ្លាឃ្មុំនៅក្នុងសារពាង្គកាយដទៃទៀត គឺកោសិកា HeLa របស់មនុស្ស និងពូជ Escherichia coli DH5α ជាតំណាងនៃកោសិកាសត្វ និងកោសិកាបាក់តេរីខ្ពស់ជាងរៀងៗខ្លួន។ នៅក្នុងស៊េរីនៃការវាស់ស្ទង់ការរីកសាយកោសិកា យើងបានសង្កេតឃើញថា coumamonamide 1, coumamonamidic acid 6 និង KAND 11 មិនបានប៉ះពាល់ដល់ការលូតលាស់របស់កោសិកា HeLa ឬ E. coli នៅកំហាប់ 100 μM (រូបភាពទី 5d, e)។
ការរារាំងការលូតលាស់របស់ KAND 11 នៅក្នុងសារពាង្គកាយដែលមិនមែនជា Arabidopsis។ (ក) សំណាបថ្នាំជក់ SR-1 ប្រភេទព្រៃអាយុពីរសប្តាហ៍ត្រូវបានដាំដុះនៅលើចាន MS ដែលដាក់បញ្ឈរដែលមាន KAND 11 ចំនួន 25 μM។ (ខ) សំណាបថ្នាំជក់ SR-1 ប្រភេទព្រៃអាយុពីរសប្តាហ៍ត្រូវបានដាំដុះនៅលើចាន MS ដែលដាក់ផ្ដេកដែលមាន KAND 11 ចំនួន 200 μM។ (គ) ពន្លកថ្លើមថ្លើម Tak-1 ប្រភេទព្រៃអាយុពីរសប្តាហ៍ដែលដាំនៅលើចាន Gamborgic B5 ជាមួយនឹងកំហាប់ KAND 11 ដែលបានចង្អុលបង្ហាញ។ ព្រួញពណ៌ក្រហមបង្ហាញពីស្ព័រដែលឈប់លូតលាស់ក្នុងរយៈពេលភ្ញាស់ពីរសប្តាហ៍។ (ឃ) ការវាយតម្លៃការរីកសាយកោសិកានៃកោសិកា HeLa។ ចំនួនកោសិកាដែលអាចរស់បានត្រូវបានវាស់វែងនៅចន្លោះពេលកំណត់ដោយប្រើឧបករណ៍រាប់កោសិកា 8 (Dojindo)។ ជាការគ្រប់គ្រង កោសិកា HeLa ត្រូវបានព្យាបាលដោយ actinomycin D (Act D) ចំនួន 5 μg/ml ដែលរារាំងការចម្លង RNA polymerase និងបណ្តាលឱ្យកោសិកាស្លាប់។ ការវិភាគត្រូវបានអនុវត្តជាបីដង។ (ង) ការវាយតម្លៃការរីកសាយកោសិកា E. coli។ ការលូតលាស់របស់ E. coli ត្រូវបានវិភាគដោយការវាស់ OD600។ ក្នុងនាមជាការគ្រប់គ្រង កោសិកាត្រូវបានព្យាបាលដោយ ampicillin (Amp) 50 μg/ml ដែលរារាំងការសំយោគជញ្ជាំងកោសិកាបាក់តេរី។ ការវិភាគត្រូវបានអនុវត្តជាបីដង។
ដើម្បីឌិគ្រីបយន្តការនៃសកម្មភាពនៃភាពពុលកោសិកាដែលបណ្តាលមកពីសមាសធាតុទាក់ទងនឹងអ៊ុយរ៉ាមីត យើងបានវិភាគឡើងវិញនូវដេរីវេអាស៊ីតអ៊ុយបេនិចដែលមានឥទ្ធិពលរារាំងកម្រិតមធ្យម។ ដូចដែលបានបង្ហាញនៅលើរូបភាព។ ដូចបង្ហាញក្នុងរូបភាពទី 2b, 6a សំណាបដែលដាំដុះនៅលើចានអាហ្គាដែលមានកំហាប់ខ្ពស់ (200 μM) នៃអាស៊ីតអ៊ុយម៉ូតូនិក 6 បានបង្កើតឫសខ្លី និងកោងខាងឆ្វេង (θ = – 23.7 ± 6.1) ខណៈពេលដែលសំណាបដែលដាំដុះនៅលើឧបករណ៍ផ្ទុកត្រួតពិនិត្យ សំណាបបានបង្កើតឫសស្ទើរតែត្រង់ (θ = – 3.8 ± 7.1)។ ការលូតលាស់បែបលំអៀងលក្ខណៈនេះត្រូវបានគេដឹងថាបណ្តាលមកពីមុខងារមិនប្រក្រតីនៃមីក្រូទូប៊ុល cortical14,18។ ស្របជាមួយនឹងការរកឃើញនេះ ថ្នាំដែលធ្វើឱ្យមីក្រូទូប៊ុលមិនស្ថិតស្ថេរ disopyramide និង oryzalin បានបង្កឱ្យមានការលំអៀងឫសស្រដៀងគ្នានៅក្រោមលក្ខខណ្ឌលូតលាស់របស់យើង (រូបភាពទី 2b, 6a)។ ក្នុងពេលជាមួយគ្នានេះ យើងបានសាកល្បងដេរីវេអាស៊ីតអ៊ុយម៉ូតូនិក ហើយបានជ្រើសរើសពួកវាជាច្រើនដែលនៅកំហាប់ជាក់លាក់ បានបង្កើតការលូតលាស់ឫសលំអៀង។ សមាសធាតុ 8, 9, និង 15 បានផ្លាស់ប្តូរទិសដៅនៃការលូតលាស់របស់ឫសនៅ 75 μM, 50 μM, និង 40 μM រៀងគ្នា ដែលបង្ហាញថាសមាសធាតុទាំងនេះអាចធ្វើឱ្យមីក្រូទូប៊ុលមិនស្ថិតស្ថេរបានយ៉ាងមានប្រសិទ្ធភាព (រូបភាពទី 2b, 6a)។ យើងក៏បានសាកល្បងដេរីវេអាស៊ីតអួរសូលីកដ៏មានឥទ្ធិពលបំផុតគឺ KAND 11 នៅកំហាប់ទាបជាង (15 µM) ហើយបានរកឃើញថាការប្រើប្រាស់ KAND 11 បានរារាំងការលូតលាស់របស់ឫស និងទិសដៅនៃការលូតលាស់របស់ឫសមិនស្មើគ្នា ទោះបីជាវាមានទំនោរទៅរកជម្រាលទៅខាងឆ្វេងក៏ដោយ (រូបភាព C3)។ ដោយសារតែកំហាប់ខ្ពស់នៃថ្នាំដែលធ្វើឱ្យមីក្រូទូប៊ុលមិនស្ថិតស្ថេរជួនកាលរារាំងការលូតលាស់របស់រុក្ខជាតិជាជាងបណ្តាលឱ្យឫសផ្អៀង ក្រោយមកយើងបានវាយតម្លៃលទ្ធភាពដែល KAND 11 ប៉ះពាល់ដល់មីក្រូទូប៊ុលដោយសង្កេតមើលមីក្រូទូប៊ុល cortical នៅក្នុងកោសិកា epidermal របស់ឫស។ ការវិភាគភាពស៊ាំដោយប្រើអង្គបដិប្រាណប្រឆាំង β-tubulin នៅក្នុងកោសិកាអេពីដេមីនៃឫសសំណាបដែលបានព្យាបាលដោយ 25 μM KAND 11 បានបង្ហាញពីការបាត់ខ្លួននៃមីក្រូទូប៊ុលស្ទើរតែទាំងអស់នៅក្នុងកោសិកាអេពីដេមីក្នុងតំបន់លាតសន្ធឹង (រូបភាពទី 6b)។ លទ្ធផលទាំងនេះបង្ហាញថា អាស៊ីតគូម៉ាម៉ូនិច និងដេរីវេរបស់វាធ្វើសកម្មភាពដោយផ្ទាល់ ឬដោយប្រយោលលើមីក្រូទូប៊ុលដើម្បីរំខានដល់ពួកវា ហើយសមាសធាតុទាំងនេះគឺជាសារធាតុទប់ស្កាត់មីក្រូទូប៊ុលថ្មី។
អាស៊ីត Ursonic និងដេរីវេរបស់វាផ្លាស់ប្តូរមីក្រូទូប៊ុល cortical នៅក្នុង Arabidopsis thaliana។ (ក) មុំទំនោររបស់ឫសដែលវាស់វែងនៅក្នុងវត្តមាននៃដេរីវេនៃអាស៊ីត urmotonic ផ្សេងៗគ្នានៅកំហាប់ដែលបានចង្អុលបង្ហាញ។ ផលប៉ះពាល់នៃសមាសធាតុពីរដែលគេស្គាល់ថារារាំងមីក្រូទូប៊ុល៖ disopyramide និង oryzalin ក៏ត្រូវបានវិភាគផងដែរ។ រូបភាពបញ្ចូលបង្ហាញពីស្តង់ដារដែលប្រើដើម្បីវាស់មុំលូតលាស់របស់ឫស។ សញ្ញាផ្កាយបង្ហាញពីភាពខុសគ្នាគួរឱ្យកត់សម្គាល់ជាមួយនឹងការព្យាបាលដោយការក្លែងបន្លំ (t test, p< ០.០៥)។ n>១៩. របារមាត្រដ្ឋាន = 1 សង់ទីម៉ែត្រ។ (ខ) មីក្រូទូប៊ុល Cortical នៅក្នុងកោសិកា Epidermal នៅក្នុងតំបន់ពន្លូត។ មីក្រូទូប៊ុលនៅក្នុងឫស Col Arabidopsis ប្រភេទព្រៃដែលដាំដុះនៅលើបន្ទះ MS ដែលមាន ឬគ្មាន 25 μM KAND 11 ត្រូវបានមើលឃើញដោយការជ្រលក់ពណ៌ immunohistochemical ដោយប្រើអង្គបដិប្រាណបឋម β-tubulin និងអង្គបដិប្រាណបន្ទាប់បន្សំ Alexa Fluor-conjugated។ របារមាត្រដ្ឋាន = 10 µm។ (គ) រចនាសម្ព័ន្ធមីតូទិកនៃមីក្រូទូប៊ុលនៅក្នុងមេរីស្ទីមឫស។ មីក្រូទូប៊ុលត្រូវបានមើលឃើញដោយប្រើការជ្រលក់ពណ៌ immunohistochemical។ រចនាសម្ព័ន្ធមីតូទិក រួមទាំងតំបន់ប្រូហ្វាស ស្ពីនឌល និងផារ៉ាកម៉ូផ្លាស ត្រូវបានរាប់ពីរូបភាពកុងហ្វូកាល់។ ព្រួញបង្ហាញពីរចនាសម្ព័ន្ធមីក្រូទូប៊ុលមីតូទិក។ សញ្ញាផ្កាយបង្ហាញពីភាពខុសគ្នាគួរឱ្យកត់សម្គាល់ជាមួយនឹងការព្យាបាលដោយការក្លែងបន្លំ (t test, p< ០.០៥)។ n>៩. របារមាត្រដ្ឋាន = 50 µm។
ទោះបីជា Ursa មានសមត្ថភាពរំខានដល់មុខងាររបស់ microtubule ក៏ដោយ យន្តការនៃសកម្មភាពរបស់វាត្រូវបានគេរំពឹងថានឹងខុសពីសារធាតុ depolymerizing microtubule ធម្មតា។ ឧទាហរណ៍ កំហាប់ខ្ពស់នៃសារធាតុ depolymerizing microtubule ដូចជា disopyramide និង oryzalin បង្កឱ្យមានការពង្រីក anisotropic នៃកោសិកា epidermal ខណៈពេលដែល KAND 11 មិនមានទេ។ លើសពីនេះ ការប្រើប្រាស់រួមគ្នានៃ KAND 11 និង disopyramide បានបង្កើតឱ្យមានការឆ្លើយតបនៃការលូតលាស់ឫសដែលបង្កឡើងដោយ disopyramide រួមគ្នា ហើយការរារាំងការលូតលាស់ដែលបង្កឡើងដោយ KAND 11 ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញ (រូបភាព S4)។ យើងក៏បានវិភាគការឆ្លើយតបនៃ disopyramide 1-1 (phs1-1) ដែលមានប្រតិកម្មខ្លាំងទៅនឹង KAND 11។ phs1-1 មានការផ្លាស់ប្តូរចំណុច tubulin kinase មិនមែនជា canonical និងបង្កើតឫសខ្លីជាងនៅពេលព្យាបាលដោយ disopyramide9,20។ សំណាបដែលមានការផ្លាស់ប្តូរ phs1-1 ដែលដាំដុះនៅលើ agar medium ដែលមាន KAND 11 មានឫសខ្លីជាងស្រដៀងគ្នាទៅនឹងសំណាបដែលដាំដុះនៅលើ disopyramid (រូបភាព S5)។
លើសពីនេះ យើងបានសង្កេតឃើញរចនាសម្ព័ន្ធមីក្រូទូប៊ុលមីតូទិក ដូចជាតំបន់ប្រូហ្វាស ស្ពីនឌល និងហ្វាក់ម៉ូផ្លាស នៅក្នុងមេរីស្ទេមឫសនៃសំណាបដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ KAND 11។ ស្របនឹងការសង្កេតសម្រាប់ CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS ការថយចុះគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៃចំនួនមីក្រូទូប៊ុលមីតូទិកត្រូវបានគេសង្កេតឃើញ (រូបភាពទី 6c)។
ដើម្បីកំណត់លក្ខណៈពុលកោសិការបស់ KAND 11 នៅពេលកម្រិតភាពច្បាស់នៃកោសិការង យើងបានព្យាបាលកោសិកាព្យួរថ្នាំជក់ BY-2 ជាមួយ KAND 11 ហើយសង្កេតមើលការឆ្លើយតបរបស់វា។ ដំបូងយើងបានបន្ថែម KAND 11 ទៅកោសិកា BY-2 ដែលបង្ហាញ TagRFP-TUA6 ដែលដាក់ស្លាកមីក្រូទូប៊ុលដោយបញ្ចេញពន្លឺ ដើម្បីវាយតម្លៃឥទ្ធិពលរបស់ KAND 11 លើមីក្រូទូប៊ុលស្រទាប់ខាងក្រៅ។ ដង់ស៊ីតេមីក្រូទូប៊ុលស្រទាប់ខាងក្រៅត្រូវបានវាយតម្លៃដោយប្រើការវិភាគរូបភាព ដែលបានវាស់បរិមាណភាគរយនៃភីកសែលគ្រោងឆ្អឹងកោសិកាក្នុងចំណោមភីកសែលស៊ីតូប្លាស្មិក។ លទ្ធផលនៃការវិភាគបានបង្ហាញថា បន្ទាប់ពីការព្យាបាលជាមួយ KAND 11 50 μM ឬ 100 μM រយៈពេល 1 ម៉ោង ដង់ស៊ីតេបានថយចុះគួរឱ្យកត់សម្គាល់ដល់ 0.94 ± 0.74% ឬ 0.23 ± 0.28% រៀងគ្នា ខណៈពេលដែលដង់ស៊ីតេនៃកោសិកាដែលបានព្យាបាលជាមួយ DMSO មានចំនួន 1.61 ± 0.34% (រូបភាពទី 7a)។ លទ្ធផលទាំងនេះស្របនឹងការសង្កេតនៅក្នុង Arabidopsis ដែលថាការព្យាបាលដោយ KAND 11 បង្កឱ្យមានការបំបែកប៉ូលីមែរនៃមីក្រូទូប៊ុល cortical (រូបភាពទី 6b)។ យើងក៏បានពិនិត្យមើលខ្សែ BY-2 ជាមួយនឹងខ្សែស្រឡាយអាកទីនដែលមានស្លាក GFP-ABD បន្ទាប់ពីការព្យាបាលជាមួយនឹងកំហាប់ដូចគ្នានៃ KAND 11 ហើយបានសង្កេតឃើញថាការព្យាបាលដោយ KAND 11 បានរំខានដល់ខ្សែស្រឡាយអាកទីន។ ការព្យាបាលជាមួយ KAND 11 50 μM ឬ 100 μM រយៈពេល 1 ម៉ោងបានកាត់បន្ថយដង់ស៊ីតេខ្សែស្រឡាយអាកទីនយ៉ាងខ្លាំងដល់ 1.20 ± 0.62% ឬ 0.61 ± 0.26% រៀងគ្នា ខណៈពេលដែលដង់ស៊ីតេនៅក្នុងកោសិកាដែលបានព្យាបាលដោយ DMSO គឺ 1.69 ± 0.51% (រូបភាពទី 2)។ លទ្ធផលទាំងនេះផ្ទុយពីឥទ្ធិពលនៃ propyzamide ដែលមិនប៉ះពាល់ដល់ខ្សែស្រឡាយអាកទីន និង latrunculin B ដែលជាសារធាតុបំបែកប៉ូលីមែរអាកទីនដែលមិនប៉ះពាល់ដល់មីក្រូទូប៊ុល (រូបភាពទី S6)។ លើសពីនេះ ការព្យាបាលជាមួយ coumamonamide 1, coumamonamide acid 6 ឬ KAND 11 មិនបានប៉ះពាល់ដល់មីក្រូទូប៊ុលនៅក្នុងកោសិកា HeLa ទេ (រូបភាព SI S7)។ ដូច្នេះ យន្តការនៃសកម្មភាពរបស់ KAND 11 ត្រូវបានគេជឿថាខុសពីសកម្មភាពរបស់សារធាតុរំខានដល់គ្រោងឆ្អឹងកោសិកាដែលគេស្គាល់។ លើសពីនេះ ការសង្កេតមីក្រូទស្សន៍របស់យើងលើកោសិកា BY-2 ដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ KAND 11 បានបង្ហាញពីការចាប់ផ្តើមនៃការស្លាប់កោសិកាក្នុងអំឡុងពេលព្យាបាលដោយ KAND 11 ហើយបានបង្ហាញថាសមាមាត្រនៃកោសិកាងាប់ដែលមានស្នាមប្រឡាក់ពណ៌ខៀវ Evans មិនបានកើនឡើងគួរឱ្យកត់សម្គាល់បន្ទាប់ពីការព្យាបាល KAND 11 រយៈពេល 30 នាទី ខណៈពេលដែលបន្ទាប់ពីការព្យាបាលរយៈពេល 90 នាទីជាមួយ 50 μM ឬ 100 μM KAND ចំនួនកោសិកាងាប់បានកើនឡើងដល់ 43.7% ឬ 80.1% រៀងគ្នា (រូបភាពទី 7c)។ សរុបមក ទិន្នន័យទាំងនេះបង្ហាញថា ដេរីវេនៃអាស៊ីត ursolic ថ្មី KAND 11 គឺជាសារធាតុទប់ស្កាត់គ្រោងឆ្អឹងកោសិកាជាក់លាក់ចំពោះរុក្ខជាតិដែលមានយន្តការនៃសកម្មភាពដែលមិនស្គាល់ពីមុន។
KAND ប៉ះពាល់ដល់មីក្រូទូប៊ុលស្រទាប់ខាងក្រៅ សរសៃអាកទីន និងលទ្ធភាពរស់រានមានជីវិតរបស់កោសិកា BY-2 ថ្នាំជក់។ (ក) ការមើលឃើញមីក្រូទូប៊ុលស្រទាប់ខាងក្រៅនៅក្នុងកោសិកា BY-2 នៅក្នុងវត្តមាននៃ TagRFP-TUA6។ កោសិកា BY-2 ដែលត្រូវបានព្យាបាលដោយ KAND 11 (50 μM ឬ 100 μM) ឬ DMSO ត្រូវបានពិនិត្យដោយមីក្រូទស្សន៍ខនហ្វូកាល់។ ដង់ស៊ីតេមីក្រូទូប៊ុលស្រទាប់ខាងក្រៅត្រូវបានគណនាពីមីក្រូក្រាហ្វនៃកោសិកាឯករាជ្យចំនួន 25។ អក្សរបង្ហាញពីភាពខុសគ្នាគួរឱ្យកត់សម្គាល់ (ការធ្វើតេស្ត Tukey HSD, ទំ< 0.05)។ របារមាត្រដ្ឋាន = 10 µm។ (ខ) ខ្សែស្រឡាយអាកទីន Cortical នៅក្នុងកោសិកា BY-2 ដែលមើលឃើញនៅក្នុងវត្តមាននៃ GFP-ABD2។ កោសិកា BY-2 ដែលបានព្យាបាលដោយ KAND 11 (50 μM ឬ 100 μM) ឬ DMSO ត្រូវបានពិនិត្យដោយមីក្រូទស្សន៍ confocal។ ដង់ស៊ីតេនៃខ្សែស្រឡាយអាកទីន Cortical ត្រូវបានគណនាពីមីក្រូទស្សន៍នៃកោសិកាឯករាជ្យចំនួន 25។ អក្សរបង្ហាញពីភាពខុសគ្នាគួរឱ្យកត់សម្គាល់ (ការធ្វើតេស្ត Tukey HSD, ទំ< 0.05)។ របារមាត្រដ្ឋាន = 10 µm។ (គ) ការសង្កេតកោសិកា BY-2 ដែលងាប់ដោយការជ្រលក់ពណ៌ Evans blue។ កោសិកា BY-2 ដែលបានព្យាបាលដោយ KAND 11 (50 μM ឬ 100 μM) ឬ DMSO ត្រូវបានពិនិត្យដោយមីក្រូទស្សន៍វាលភ្លឺ។ n=3។ របារមាត្រដ្ឋាន = 100 µm។
ការរកឃើញ និងការអនុវត្តផលិតផលធម្មជាតិថ្មីៗ បាននាំឱ្យមានការរីកចម្រើនគួរឱ្យកត់សម្គាល់នៅក្នុងទិដ្ឋភាពផ្សេងៗនៃជីវិតមនុស្ស រួមទាំងវេជ្ជសាស្ត្រ និងកសិកម្ម។ ការស្រាវជ្រាវប្រវត្តិសាស្ត្រត្រូវបានអនុវត្ត ដើម្បីទទួលបានសមាសធាតុមានប្រយោជន៍ពីធនធានធម្មជាតិ។ ជាពិសេស អាកទីណូមីស៊ីត ត្រូវបានគេដឹងថាមានប្រយោជន៍ជាថ្នាំអង់ទីប៊ីយោទិចប្រឆាំងនឹងប៉ារ៉ាស៊ីតសម្រាប់ណេម៉ាតូត ដោយសារតែសមត្ថភាពរបស់វាក្នុងការផលិតសារធាតុរំលាយអាហារបន្ទាប់បន្សំជាច្រើនដូចជា អាវើរម៉ិចទីន ដែលជាសមាសធាតុនាំមុខនៃ ivermectin និង bleomycin និងដេរីវេរបស់វា ដែលត្រូវបានប្រើជាឱសថជាភ្នាក់ងារប្រឆាំងមហារីក21,22។ ដូចគ្នានេះដែរ សមាសធាតុសម្លាប់ស្មៅជាច្រើនប្រភេទត្រូវបានគេរកឃើញពី អាកទីណូមីស៊ីត ដែលខ្លះត្រូវបានប្រើប្រាស់រួចហើយសម្រាប់ពាណិជ្ជកម្ម1,23។ ដូច្នេះ ការវិភាគសារធាតុរំលាយអាហារអាកទីណូមីស៊ីត ដើម្បីញែកផលិតផលធម្មជាតិជាមួយនឹងសកម្មភាពជីវសាស្រ្តដែលចង់បាន ត្រូវបានចាត់ទុកថាជាយុទ្ធសាស្ត្រដ៏មានប្រសិទ្ធភាព។ នៅក្នុងការសិក្សានេះ យើងបានរកឃើញសមាសធាតុថ្មីមួយគឺ coumamonamide ពី S. werraensis ហើយបានសំយោគវាដោយជោគជ័យ។ អាស៊ីត Ursonic គឺជាសារធាតុសំយោគកម្រិតមធ្យមនៃ urbenamide និងដេរីវេរបស់វា។ វាអាចបណ្តាលឱ្យឫសរួញលក្ខណៈ បង្ហាញសកម្មភាពសម្លាប់ស្មៅកម្រិតមធ្យមទៅខ្លាំង និងបំផ្លាញមីក្រូទូប៊ុលរុក្ខជាតិដោយផ្ទាល់ ឬដោយប្រយោល។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ យន្តការនៃសកម្មភាពរបស់អាស៊ីត urmotonic អាចខុសពីថ្នាំទប់ស្កាត់ microtubule ដែលមានស្រាប់ ដោយសារ KAND 11 ក៏រំខានដល់ខ្សែស្រឡាយ actin និងបណ្តាលឱ្យកោសិកាស្លាប់ផងដែរ ដែលបង្ហាញពីយន្តការនិយតកម្មដែលអាស៊ីត urmotonic និងដេរីវេរបស់វាមានឥទ្ធិពលលើរចនាសម្ព័ន្ធ cytoskeletal ជាច្រើនប្រភេទ។
ការកំណត់លក្ខណៈលម្អិតបន្ថែមនៃអាស៊ីត urbenonic នឹងជួយឲ្យយល់កាន់តែច្បាស់អំពីយន្តការនៃសកម្មភាពរបស់អាស៊ីត urbenonic។ ជាពិសេស គោលដៅបន្ទាប់គឺដើម្បីវាយតម្លៃសមត្ថភាពរបស់អាស៊ីត ursonic ក្នុងការចងទៅនឹងមីក្រូ tubules ដែលត្រូវបានកាត់បន្ថយ ដើម្បីកំណត់ថាតើអាស៊ីត ursonic និងដេរីវេរបស់វាធ្វើសកម្មភាពដោយផ្ទាល់លើមីក្រូ tubules និងធ្វើឲ្យវាមិនស្ថិតស្ថេរឬអត់ ឬថាតើសកម្មភាពរបស់វាបណ្តាលឲ្យមីក្រូ tubules មិនស្ថិតស្ថេរឬអត់។ លើសពីនេះ ក្នុងករណីដែលមីក្រូ tubules មិនមែនជាគោលដៅផ្ទាល់ ការកំណត់ទីតាំងនៃសកម្មភាព និងគោលដៅម៉ូលេគុលនៃអាស៊ីត ursonic លើកោសិការុក្ខជាតិនឹងជួយយល់បន្ថែមអំពីលក្ខណៈសម្បត្តិនៃសមាសធាតុពាក់ព័ន្ធ និងវិធីដែលអាចធ្វើទៅបានដើម្បីកែលម្អសកម្មភាពថ្នាំសម្លាប់ស្មៅ។ ការវិភាគសកម្មភាពជីវសាស្ត្ររបស់យើងបានបង្ហាញពីសមត្ថភាពពុលកោសិកាពិសេសរបស់អាស៊ីត ursonic លើការលូតលាស់របស់រុក្ខជាតិដូចជា Arabidopsis thaliana ថ្នាំជក់ និងលីវវ័រត ខណៈដែលទាំងកោសិកា E. coli និង HeLa មិនត្រូវបានប៉ះពាល់ទេ។ ការពុលតិចតួច ឬគ្មានចំពោះកោសិកាសត្វគឺជាអត្ថប្រយោជន៍នៃដេរីវេអាស៊ីត ursonic ប្រសិនបើវាត្រូវបានបង្កើតឡើងជាថ្នាំសម្លាប់ស្មៅសម្រាប់ប្រើប្រាស់ក្នុងវាលកសិកម្មបើកចំហ។ ជាការពិតណាស់ ដោយសារមីក្រូ tubules គឺជារចនាសម្ព័ន្ធទូទៅក្នុងអឺការីយ៉ូត ការរារាំងជ្រើសរើសរបស់វានៅក្នុងរុក្ខជាតិគឺជាតម្រូវការសំខាន់សម្រាប់ថ្នាំសម្លាប់ស្មៅ។ ឧទាហរណ៍ ប្រូភីហ្សាមីត ដែលជាសារធាតុបំបែកប៉ូលីមែររបស់មីក្រូទូប៊ុល ដែលភ្ជាប់ដោយផ្ទាល់ទៅនឹងទូប៊ុលលីន និងរារាំងប៉ូលីមែរ ត្រូវបានគេប្រើជាថ្នាំសម្លាប់ស្មៅដោយសារតែវាមានជាតិពុលទាបចំពោះកោសិកាសត្វ24។ ផ្ទុយពីឌីសូភីរ៉ាមីត បេនហ្សាមីតដែលពាក់ព័ន្ធមានភាពជាក់លាក់គោលដៅខុសៗគ្នា។ បន្ថែមពីលើមីក្រូទូប៊ុលរុក្ខជាតិ RH-4032 ឬប៊ែនហ្សាមីតក៏រារាំងមីក្រូទូប៊ុលនៃកោសិកាសត្វ ឬអូមីសេតរៀងៗខ្លួនផងដែរ ហើយហ្សាលីឡាមីតត្រូវបានគេប្រើជាថ្នាំសម្លាប់ផ្សិតដោយសារតែមានជាតិពុលរុក្ខជាតិទាប25,26,27។ ខ្លាឃ្មុំដែលទើបរកឃើញថ្មី និងដេរីវេរបស់វាបង្ហាញពីជាតិពុលកោសិកាជ្រើសរើសប្រឆាំងនឹងរុក្ខជាតិ ប៉ុន្តែវាគួរឱ្យកត់សម្គាល់ថា ការកែប្រែបន្ថែមទៀតអាចផ្លាស់ប្តូរភាពជាក់លាក់គោលដៅរបស់វា ដែលអាចផ្តល់នូវដេរីវេបន្ថែមសម្រាប់ការគ្រប់គ្រងផ្សិតបង្កជំងឺ ឬអូមីសេត។
លក្ខណៈសម្បត្តិតែមួយគត់នៃអាស៊ីត urbenonic និងដេរីវេរបស់វាមានប្រយោជន៍សម្រាប់ការអភិវឌ្ឍរបស់វាជាថ្នាំសម្លាប់ស្មៅ និងប្រើប្រាស់ជាឧបករណ៍ស្រាវជ្រាវ។ សារៈសំខាន់នៃ cytoskeleton ក្នុងការគ្រប់គ្រងរូបរាងកោសិការុក្ខជាតិត្រូវបានទទួលស្គាល់យ៉ាងទូលំទូលាយ។ ការសិក្សាមុនៗបានបង្ហាញថា រុក្ខជាតិបានវិវត្តន៍យន្តការស្មុគស្មាញនៃការរៀបចំ microtubule cortical ដោយការគ្រប់គ្រងថាមវន្ត microtubule ដើម្បីគ្រប់គ្រង morphogenesis ឱ្យបានត្រឹមត្រូវ។ ម៉ូលេគុលមួយចំនួនធំដែលទទួលខុសត្រូវចំពោះការគ្រប់គ្រងសកម្មភាព microtubule ត្រូវបានកំណត់អត្តសញ្ញាណ ហើយការស្រាវជ្រាវពាក់ព័ន្ធនៅតែបន្ត។ ការយល់ដឹងបច្ចុប្បន្នរបស់យើងអំពីថាមវន្ត microtubule នៅក្នុងកោសិការុក្ខជាតិមិនបានពន្យល់យ៉ាងពេញលេញអំពីយន្តការនៃការរៀបចំ microtubule cortical នោះទេ។ ឧទាហរណ៍ ទោះបីជា disopyramide និង oryzalin អាចធ្វើឱ្យ microtubules ចុះខ្សោយក៏ដោយ disopyramide បណ្តាលឱ្យមានការបង្ខូចទ្រង់ទ្រាយឫសធ្ងន់ធ្ងរ ខណៈពេលដែល oryzalin មានឥទ្ធិពលស្រាល។ លើសពីនេះ ការផ្លាស់ប្តូរនៅក្នុង tubulin ដែលធ្វើឱ្យ microtubules មានស្ថេរភាព ក៏បណ្តាលឱ្យមានការបង្វិល dextro នៅក្នុងឫសផងដែរ ខណៈពេលដែល paclitaxel ដែលក៏ធ្វើឱ្យថាមវន្ត microtubule មានស្ថេរភាពផងដែរ មិនបណ្តាលឱ្យមានការបង្វិល dextro នៅក្នុងឫសនោះទេ។ ដូច្នេះ ការសិក្សា និងការកំណត់អត្តសញ្ញាណគោលដៅម៉ូលេគុលនៃអាស៊ីត ursolic គួរតែផ្តល់នូវការយល់ដឹងថ្មីៗអំពីបទប្បញ្ញត្តិនៃមីក្រូ tubules cortical រុក្ខជាតិ។ ដូចគ្នានេះដែរ ការប្រៀបធៀបនាពេលអនាគតនៃសារធាតុគីមីដែលមានប្រសិទ្ធភាពក្នុងការជំរុញការលូតលាស់បង្ខូចទ្រង់ទ្រាយ ដូចជា disopyramide និងសារធាតុគីមីដែលមិនសូវមានប្រសិទ្ធភាព ដូចជា oryzalin ឬអាស៊ីត kumamotoric នឹងផ្តល់តម្រុយអំពីរបៀបដែលការលូតលាស់បង្ខូចទ្រង់ទ្រាយកើតឡើង។
ម៉្យាងវិញទៀត ការរៀបចំឡើងវិញនូវគ្រោងឆ្អឹងកោសិកាដែលទាក់ទងនឹងការការពារគឺជាលទ្ធភាពមួយផ្សេងទៀតដើម្បីពន្យល់ពីភាពពុលកោសិកានៃអាស៊ីត ursonic ។ ការឆ្លងមេរោគនៃភ្នាក់ងារបង្ករោគ ឬការណែនាំនៃសារធាតុ elicitor ចូលទៅក្នុងកោសិការុក្ខជាតិជួនកាលបណ្តាលឱ្យមានការបំផ្លាញគ្រោងឆ្អឹងកោសិកា និងការស្លាប់កោសិកាជាបន្តបន្ទាប់29។ ឧទាហរណ៍ cryptoxanthin ដែលមានប្រភពមកពី oomycete ត្រូវបានគេរាយការណ៍ថារំខានដល់ microtubules និង filaments actin មុនពេលការស្លាប់កោសិកាថ្នាំជក់ ស្រដៀងគ្នាទៅនឹងអ្វីដែលកើតឡើងជាមួយនឹងការព្យាបាលដោយ KAND30,31។ ភាពស្រដៀងគ្នារវាងការឆ្លើយតបការពារ និងការឆ្លើយតបកោសិកាដែលបង្កឡើងដោយអាស៊ីត ursonic បាននាំឱ្យយើងសន្និដ្ឋានថាពួកវាបង្កឱ្យមានដំណើរការកោសិកាទូទៅ ទោះបីជាឥទ្ធិពលលឿន និងខ្លាំងជាងនៃអាស៊ីត ursonic ជាង cryptoxanthin គឺជាក់ស្តែងក៏ដោយ។ ទោះជាយ៉ាងណាក៏ដោយ ការសិក្សាបានបង្ហាញថាការរំខានដល់ filaments actin ជំរុញការស្លាប់កោសិកាដោយឯកឯង ដែលមិនតែងតែអមដោយការរំខាន microtubule29។ លើសពីនេះ វានៅតែត្រូវមើលថាតើភ្នាក់ងារបង្ករោគ ឬ elicitor បណ្តាលឱ្យមានការលូតលាស់ឫសខូចទ្រង់ទ្រាយ ដូចដែលដេរីវេនៃអាស៊ីត ursonic ធ្វើដែរឬទេ។ ដូច្នេះ ចំណេះដឹងម៉ូលេគុលដែលភ្ជាប់ការឆ្លើយតបការពារ និងគ្រោងឆ្អឹងកោសិកា គឺជាបញ្ហាដ៏គួរឱ្យទាក់ទាញមួយដែលត្រូវដោះស្រាយ។ តាមរយៈការកេងប្រវ័ញ្ចវត្តមាននៃសមាសធាតុទម្ងន់ម៉ូលេគុលទាបដែលទាក់ទងនឹងអាស៊ីត ursonic ក៏ដូចជាដេរីវេមួយចំនួនដែលមានសមត្ថភាពខុសៗគ្នា ពួកវាអាចផ្តល់ឱកាសដើម្បីកំណត់គោលដៅយន្តការកោសិកាដែលមិនស្គាល់។
ប្រសិនបើយើងពិចារណារួមគ្នា ការរកឃើញ និងការអនុវត្តសមាសធាតុថ្មីៗដែលកែប្រែឌីណាមិកមីក្រូទូប៊ុលនឹងផ្តល់នូវវិធីសាស្រ្តដ៏មានឥទ្ធិពលដើម្បីដោះស្រាយយន្តការម៉ូលេគុលស្មុគស្មាញដែលជាមូលដ្ឋានគ្រឹះនៃការកំណត់រូបរាងកោសិការុក្ខជាតិ។ នៅក្នុងបរិបទនេះ សមាសធាតុអាស៊ីតអ៊ុយម៉ូតូនិកដែលទើបនឹងបង្កើតថ្មី ដែលប៉ះពាល់ដល់មីក្រូទូប៊ុល និងសរសៃអាកទីន និងបង្កឱ្យមានការស្លាប់កោសិកា អាចផ្តល់ឱកាសដើម្បីឌិគ្រីបទំនាក់ទំនងរវាងការគ្រប់គ្រងមីក្រូទូប៊ុល និងយន្តការផ្សេងទៀតទាំងនេះ។ ដូច្នេះ ការវិភាគគីមី និងជីវសាស្រ្តដោយប្រើអាស៊ីតអ៊ុយប៊ីណូនិកនឹងជួយយើងឱ្យយល់អំពីយន្តការនិយតកម្មម៉ូលេគុលដែលគ្រប់គ្រងគ្រោងឆ្អឹងកោសិការុក្ខជាតិ។
ចាក់ S. werraensis MK493-CF1 ចូលទៅក្នុងដប Erlenmeyer ចំណុះ 500 មីលីលីត្រ ដែលមានឧបករណ៍ផ្ទុកគ្រាប់ពូជចំនួន 110 មីលីលីត្រ ដែលមាន galactose 2% (w/v) ម្សៅ Essence 2% (w/v) សមាសធាតុ Bacto 1% (w/v) -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.) សារធាតុចម្រាញ់ពីពោត 0.5% (w/v) (KOGOSTCH Co., Ltd., ជប៉ុន) 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 និង 0.2% CaCO3 ក្នុងទឹកដែលគ្មានអ៊ីយ៉ុង (pH 7.4 មុនពេលក្រៀវ)។ វប្បធម៌គ្រាប់ពូជត្រូវបានភ្ញាស់នៅលើម៉ាស៊ីនញ័របង្វិល (180 rpm) នៅសីតុណ្ហភាព 27°C រយៈពេល 2 ថ្ងៃ។ ការដាំដុះផលិតកម្មតាមរយៈដំណើរការ fermentation រឹង។ វប្បធម៌គ្រាប់ពូជ (7 មីលីលីត្រ) ត្រូវបានផ្ទេរចូលទៅក្នុងដប K-1 ចំណុះ 500 មីលីលីត្រ ដែលមានឧបករណ៍ផលិត 40 ក្រាម ដែលមានស្រូវសាលីច្របាច់ចំនួន 15 ក្រាម (MUSO Co., Ltd., ប្រទេសជប៉ុន) និងទឹកដែលគ្មានអ៊ីយ៉ុងចំនួន 25 ក្រាម (pH មិនត្រូវបានកែតម្រូវមុនពេលក្រៀវ)។ ការ fermentation ត្រូវបានអនុវត្តនៅសីតុណ្ហភាព 30°C ក្នុងទីងងឹតរយៈពេល 14 ថ្ងៃ។ សម្ភារៈ fermentation ត្រូវបានស្រង់ចេញជាមួយ EtOH 40 មីលីលីត្រ/ដប ហើយបង្វិល (1500 ក្រាម, 4°C, 10 នាទី)។ សារធាតុចិញ្ចឹមលើស (60 មីលីលីត្រ) ត្រូវបានស្រង់ចេញជាមួយល្បាយនៃ 10% MeOH/EtOAc។ ស្រទាប់សរីរាង្គត្រូវបានហួតក្រោមសម្ពាធថយចុះ ដើម្បីទទួលបានសំណល់ (59.5 មីលីក្រាម) ដែលត្រូវបានទទួលរងនូវ HPLC ជាមួយនឹងសារធាតុ elution gradient (0–10 នាទី: 90%) នៅលើជួរឈរដំណាក់កាលបញ្ច្រាស (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × ប្រវែង 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 នាទី: 90% H2O/CH3CN ដល់ 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 នាទី: 90% H2O/EtOH, 45–155 នាទី: 90% H2O/EtOH ដល់ 100% EtOH (gradient (gradient), 155–200 នាទី: 100% EtOH) ក្នុងអត្រាលំហូរ 1.5 មីលីលីត្រ/នាទី coumamonamide (1, 36.0 មីលីក្រាម) ត្រូវបានញែកចេញជាម្សៅ amorphous ពណ៌ស។
គូម៉ាម៉ូតូអាមីដ(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H)។ ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ តម្លៃគណនា៖ 141.0659, តម្លៃវាស់៖ 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1។
គ្រាប់ពូជ Columbia (Col-0) ទទួលបានពីមជ្ឈមណ្ឌលធនធានជីវសាស្ត្រ Arabidopsis (ABRC) ដោយមានការអនុញ្ញាតសម្រាប់ការប្រើប្រាស់ស្រាវជ្រាវ។ គ្រាប់ពូជ Col-0 ត្រូវបានបន្តពូជ និងថែទាំក្រោមលក្ខខណ្ឌមន្ទីរពិសោធន៍របស់យើង ហើយត្រូវបានប្រើជារុក្ខជាតិ Arabidopsis ប្រភេទព្រៃ។ គ្រាប់ពូជ Arabidopsis ត្រូវបានសម្លាប់មេរោគលើផ្ទៃ និងដាំដុះក្នុងឧបករណ៍ផ្ទុក Murashige និង Skoog កម្លាំងពាក់កណ្តាលដែលមានផ្ទុក sucrose 2% (Fujifilm Wako Pure Chemical) 0.05% (w/v) 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical)) និង agar 1.5% (Fujifilm Wako Pure Chemical) pH 5.7 នៅសីតុណ្ហភាព 23°C និងពន្លឺថេរ។ គ្រាប់ពូជនៃម្យូតង់ phs1-1 ត្រូវបានផ្តល់ដោយ T. Hashimoto (វិទ្យាស្ថានវិទ្យាសាស្ត្រ និងបច្ចេកវិទ្យាណារ៉ា)។
គ្រាប់ពូជពូជ SR-1 ត្រូវបានផ្តល់ឱ្យដោយ T. Hashimoto (វិទ្យាស្ថានវិទ្យាសាស្ត្រ និងបច្ចេកវិទ្យាណារ៉ា) ហើយត្រូវបានប្រើជារុក្ខជាតិថ្នាំជក់ព្រៃ។ គ្រាប់ពូជថ្នាំជក់ត្រូវបានសម្លាប់មេរោគលើផ្ទៃរុក្ខជាតិ និងត្រាំក្នុងទឹកសម្លាប់មេរោគរយៈពេលបីយប់ ដើម្បីជំរុញដំណុះ បន្ទាប់មកដាក់ក្នុងដំណោះស្រាយកម្លាំងពាក់កណ្តាលដែលមានស៊ុយក្រូស 2% សារធាតុ MES 0.05% (w/v) និងជ័រជែលឡាន 0.8% (សារធាតុ Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. និង Skoog medium) ដែលមាន pH 5.7 ហើយភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាព 23°C ក្រោមពន្លឺថេរ។
ពូជ Tak-1 ត្រូវបានផ្តល់ដោយ T. Kohchi (សាកលវិទ្យាល័យក្យូតូ) ហើយត្រូវបានប្រើជាឯកតាពិសោធន៍ស្តង់ដារសម្រាប់ការសិក្សាអំពី liverwort។ Gemma ត្រូវបានទទួលពីរុក្ខជាតិដាំដុះដែលបានក្រៀវ ហើយបន្ទាប់មកដាក់លើឧបករណ៍ផ្ទុក Gamborgic B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) ដែលមានជាតិស្ករ sucrose 1% និង gellan gum 0.3% ហើយភ្ញាស់នៅសីតុណ្ហភាព 23°C ក្រោមពន្លឺបន្ត។
កោសិកា Tobacco BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) ត្រូវបានផ្តល់ដោយ S. Hasezawa (សាកលវិទ្យាល័យតូក្យូ)។ កោសិកា BY-2 ត្រូវបានពនលាយ 95 ដងក្នុងឧបករណ៍លាយ Linsmeier និង Skoog ដែលបានកែប្រែ ហើយត្រូវបានបំពេញបន្ថែមជារៀងរាល់សប្តាហ៍ជាមួយអាស៊ីត 2,4-dichlorophenoxyacetic 32។ ស៊ុស្ប៉ង់ស្យុងកោសិកាត្រូវបានលាយបញ្ចូលគ្នានៅលើម៉ាស៊ីនញ័របង្វិលក្នុងល្បឿន 130 rpm នៅសីតុណ្ហភាព 27°C ក្នុងទីងងឹត។ លាងសម្អាតកោសិកាជាមួយនឹងឧបករណ៍លាយស្រស់ដែលមានបរិមាណច្រើនជាង 10 ដង ហើយរំលាយឡើងវិញក្នុងឧបករណ៍លាយដូចគ្នា។ ខ្សែកោសិកាប្តូរហ្សែន BY-2 ដែលបង្ហាញសញ្ញាសម្គាល់ microtubule TagRFP-TUA6 ឬសញ្ញាសម្គាល់ actin filament GFP-ABD2 ដែលមានស្ថេរភាពនៅក្រោមប្រូម៉ូទ័រមេរោគ cauliflower mosaic virus 35S ត្រូវបានបង្កើតដូចដែលបានពិពណ៌នា33,34,35។ ខ្សែកោសិកាទាំងនេះអាចត្រូវបានថែរក្សា និងធ្វើសមកាលកម្មដោយប្រើនីតិវិធីស្រដៀងគ្នាទៅនឹងនីតិវិធីដែលប្រើសម្រាប់ខ្សែកោសិកា BY-2 ដើម។
កោសិកា HeLa ត្រូវបានដាំដុះនៅក្នុងឧបករណ៍ភ្ញាស់ពងកូន Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) ដែលបានបន្ថែមជាមួយសេរ៉ូមគោគភ៌ 10% ប៉េនីស៊ីលីន 1.2 U/ml និងស្ទ្រីបតូម៉ីន 1.2 μg/ml នៅក្នុងឧបករណ៍ភ្ញាស់ពងដែលមានសីតុណ្ហភាព 37°C ជាមួយ CO2 5%។
ការពិសោធន៍ទាំងអស់ដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុងសាត្រាស្លឹករឹតនេះត្រូវបានអនុវត្តស្របតាមបទប្បញ្ញត្តិ និងគោលការណ៍ណែនាំអំពីសុវត្ថិភាពជីវសាស្រ្តរបស់ប្រទេសជប៉ុន។
សមាសធាតុត្រូវបានរំលាយក្នុងឌីមេទីលស៊ុលហ្វុកស៊ីត (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) ជាដំណោះស្រាយស្តុក ហើយពនលាយក្នុងឧបករណ៍ផ្សព្វផ្សាយ MS សម្រាប់ Arabidopsis និងថ្នាំជក់ ឬឧបករណ៍ផ្សព្វផ្សាយ Gambog B5 សម្រាប់ liverwort។ ចំពោះការវាយតម្លៃការរារាំងការលូតលាស់របស់ឫស គ្រាប់ពូជច្រើនជាង 10 ក្នុងមួយចានត្រូវបានសាបព្រោះលើឧបករណ៍ផ្សព្វផ្សាយ agar ដែលមានសមាសធាតុដែលបានចង្អុលបង្ហាញ ឬ DMSO។ គ្រាប់ពូជត្រូវបានភ្ញាស់ក្នុងបន្ទប់លូតលាស់រយៈពេល 7 ថ្ងៃ។ សំណាបត្រូវបានថតរូប ហើយប្រវែងនៃឫសត្រូវបានវាស់។ ចំពោះការវាយតម្លៃដំណុះរបស់ Arabidopsis គ្រាប់ពូជចំនួន 48 ក្នុងមួយចានត្រូវបានសាបព្រោះលើឧបករណ៍ផ្សព្វផ្សាយ agar ដែលមានសមាសធាតុ 200 μM ឬ DMSO។ គ្រាប់ពូជ Arabidopsis ត្រូវបានដាំដុះក្នុងបន្ទប់លូតលាស់ ហើយចំនួនសំណាបដែលដុះពន្លកត្រូវបានរាប់ 7 ថ្ងៃបន្ទាប់ពីដំណុះ (dag)។ ចំពោះការវាយតម្លៃដំណុះថ្នាំជក់ គ្រាប់ពូជចំនួន 24 ក្នុងមួយចានត្រូវបានសាបព្រោះលើឧបករណ៍ផ្សព្វផ្សាយ agar ដែលមាន KAND ឬ DMSO 200 μM។ គ្រាប់ពូជថ្នាំជក់ត្រូវបានដាំដុះក្នុងបន្ទប់លូតលាស់ ហើយចំនួនសំណាបដែលដុះពន្លកត្រូវបានរាប់បន្ទាប់ពី 14 ថ្ងៃ។ ចំពោះការវាស់ស្ទង់ការរារាំងការលូតលាស់របស់ liverwort អំប្រ៊ីយ៉ុងចំនួន 9 ពីបន្ទះនីមួយៗត្រូវបានដាក់លើឧបករណ៍ផ្ទុក agar ដែលមានកំហាប់ KAND ឬ DMSO ដែលបានចង្អុលបង្ហាញ ហើយភ្ញាស់នៅក្នុងបន្ទប់លូតលាស់រយៈពេល 14 ថ្ងៃ។
ប្រើសំណាបដែលជ្រលក់ពណ៌ជាមួយ propidium iodide (PI) 5 mg/ml ដើម្បីមើលឃើញការរៀបចំមេរីស្តេមឫស។ សញ្ញា PI ត្រូវបានសង្កេតឃើញដោយមីក្រូទស្សន៍ហ្វ្លុយអូរីស ដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍ស្កេនឡាស៊ែរ TCS SPE confocal (Leica Microsystems)។
ការជ្រលក់ពណ៌ហ៊ីស្តូគីមីនៃឫសជាមួយ β-glucuronidase (GUS) ត្រូវបានអនុវត្តស្របតាមពិធីការដែលបានពិពណ៌នាដោយ Malami និង Benfey36។ សំណាបត្រូវបានជ្រលក់ក្នុងអាសេតូន 90% ពេញមួយយប់ ជ្រលក់ជាមួយអាស៊ីត 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic កំហាប់ 0.5 mg/ml ក្នុងសារធាតុ GUS buffer រយៈពេល 1 ម៉ោង ហើយដាក់ក្នុងដំណោះស្រាយក្លរ៉ាល់ដេអ៊ីតដែលមានជាតិអ៊ីដ្រាត។ (ក្លរ៉ាល់អ៊ីដ្រាត 8 ក្រាម ទឹក 2 មីលីលីត្រ និងគ្លីសេរ៉ុល 1 មីលីលីត្រ) ហើយសង្កេតឃើញដោយមីក្រូទស្សន៍កម្រិតពណ៌ឌីផេរ៉ង់ស្យែលដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍ Axio Imager M1 (Carl Zeiss)។
មុំឫសត្រូវបានវាស់លើសំណាបអាយុ 7 ថ្ងៃដែលដាំនៅលើចានដែលដាក់បញ្ឈរ។ វាស់មុំឫសពីទិសដៅនៃវ៉ិចទ័រទំនាញដូចដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុងជំហានទី 6។
ការរៀបចំមីក្រូទូប៊ុលនៃស្រទាប់ខាងក្រៅត្រូវបានគេសង្កេតឃើញដូចដែលបានពិពណ៌នា ជាមួយនឹងការកែប្រែបន្តិចបន្តួចចំពោះពិធីការ 37។ អង្គបដិប្រាណប្រឆាំងបេតា-ទូប៊ុលលីន (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) និងអង្គបដិប្រាណប្រឆាំងកណ្ដុរ IgG ដែលភ្ជាប់ជាមួយ Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) ត្រូវបានប្រើជាអង្គបដិប្រាណបឋម និងទីពីរនៅកំហាប់ពនលាយ 1:1000 និង 1:100 រៀងៗខ្លួន។ រូបភាពហ្វ្លុយអូរីសង់ត្រូវបានទទួលដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍ស្កេនឡាស៊ែរខនហ្វូកាល់ TCS SPE (Leica Microsystems)។ ទទួលបានរូបភាព Z-stack ហើយបង្កើតការព្យាករណ៍អាំងតង់ស៊ីតេអតិបរមាស្របតាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិត។
ការវិភាគការរីកសាយកោសិកា HeLa ត្រូវបានអនុវត្តដោយប្រើឧបករណ៍រាប់កោសិកាលេខ 8 (Dojindo) ស្របតាមការណែនាំរបស់អ្នកផលិត។
ការលូតលាស់របស់ E. coli DH5α ត្រូវបានវិភាគដោយវាស់ដង់ស៊ីតេកោសិកាក្នុងការដាំដុះដោយប្រើម៉ាស៊ីនវិភាគវិសាលគមនៅរលកពន្លឺ 600 nm (OD600)។
ការរៀបចំរចនាសម្ព័ន្ធគ្រោងឆ្អឹងនៅក្នុងកោសិកា BY-2 ដែលបានប្តូរហ្សែនត្រូវបានគេសង្កេតឃើញដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍ហ្វ្លុយអូរីសដែលបំពាក់ដោយឧបករណ៍ស្កេនខនហ្វូកាល់ CSU-X1 (Yokogawa) និងកាមេរ៉ា sCMOS (Zyla, Andor Technology)។ ដង់ស៊ីតេគ្រោងឆ្អឹងត្រូវបានវាយតម្លៃដោយការវិភាគរូបភាព ដែលបានវាស់វែងភាគរយនៃភីកសែលគ្រោងឆ្អឹងក្នុងចំនោមភីកសែលស៊ីតូប្លាស្មិកនៅក្នុងរូបភាពខនហ្វូកាល់ដោយប្រើកម្មវិធី ImageJ ដូចដែលបានពិពណ៌នា38,39។
ដើម្បីរកឃើញការស្លាប់កោសិកានៅក្នុងកោសិកា BY-2 បរិមាណនៃស៊ុស្ប៉ង់ស្យុងកោសិកាត្រូវបានភ្ញាស់ជាមួយពណ៌ខៀវ Evans 0.05% រយៈពេល 10 នាទីនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ ការជ្រលក់ពណ៌ពណ៌ខៀវ Evans ជ្រើសរើសនៃកោសិកាងាប់អាស្រ័យលើការច្របាច់ថ្នាំជ្រលក់ចេញពីកោសិកាដែលអាចរស់បានដោយភ្នាសប្លាស្មាដែលនៅដដែល40។ កោសិកាដែលមានស្នាមប្រឡាក់ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញដោយប្រើមីក្រូទស្សន៍វាលភ្លឺ (BX53, Olympus)។
កោសិកា HeLa ត្រូវបានដាំដុះនៅក្នុង DMEM ដែលបានបន្ថែមជាមួយ 10% FBS នៅក្នុងឧបករណ៍ភ្ញាស់ដែលមានសំណើមនៅសីតុណ្ហភាព 37°C និង 5% CO2។ កោសិកាត្រូវបានព្យាបាលដោយ 100 μM KAND 11, kumamonamic acid 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco) ឬ 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) រយៈពេល 6 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 37°C។ កោសិកាត្រូវបានជួសជុលជាមួយ MetOH រយៈពេល 10 នាទី ហើយបន្ទាប់មកជាមួយ acetate រយៈពេល 5 នាទីនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ កោសិកាដែលត្រូវបានជួសជុលត្រូវបានភ្ញាស់ជាមួយអង្គបដិប្រាណបឋម β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) ដែលពនលាយក្នុង 0.5% BSA/PBS រយៈពេល 2 ម៉ោង លាងសម្អាត 3 ដងជាមួយ TBST ហើយបន្ទាប់មកភ្ញាស់ជាមួយអង្គបដិប្រាណពពែ Alexa Fluor។ 488 1 ម៉ោង។ – អង្គបដិប្រាណ IgG កណ្ដុរ (Thermo Fisher Scientific: A11001) និង 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ដែលពនលាយក្នុង 0.5% BSA/PBS។ បន្ទាប់ពីលាងសម្អាតជាមួយ TBST បីដង កោសិកាដែលមានស្នាមប្រឡាក់ត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅលើមីក្រូទស្សន៍ Nikon Eclipse Ti-E ដែលដាក់បញ្ច្រាស។ រូបភាពត្រូវបានថតដោយកាមេរ៉ា CCD Hamamatsu ORCA-R2 ដែលត្រជាក់ដោយប្រើកម្មវិធី MetaMorph (Molecular Devices)។
ពេលវេលាបង្ហោះ៖ ថ្ងៃទី ១៧ ខែមិថុនា ឆ្នាំ ២០២៤